Palabras clave: Resistencia a múltiples drogas; Mycobacterium tuberculosis; Farmacorresistencia microbiana (fuente: DeCS BIREME).

ABSTRACT

Objectives. To determine the drug resistance profiles for quinolones: ciprofloxacin (CFX), ofloxacin (OFX), moxifloxacin (MFX), and gatifloxacin (GFX); and for injectables: kanamycin (KAN), amikacin (AMK), and capreomycin (CAP) in multidrug resistant (MDR) strains. We also investigated the correlation between mutations in rrs, tlyA and gyrA/B genes, and the in vitro resistance to the second-line anti-tuberculosis drugs. Materials and methods. In this pilot study we selected MDR clinical isolates collected from June-December 2004 in the Tropical Medicine Institute "Alexander von Humboldt" (Lima, Perú). The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of CFX, OFX, MFX, GFX, KAN, AMK and CAP for 14 clinical isolates were determined and the sequences of rrs, tlyA and gyrA/B genes were analyzed by conventional PCR followed by sequencing. Results. We obtained valid results for 11 samples. Four isolates were resistant to injectable drugs, and in all the cases the MICs were; >120 µg/mL for KAN and >160 µg/mL for AMK and CAP. Only 2 isolates were resistant to OFX with MIC = 4 µg/mL. Sequencing results suggested that the mutation A1401T in rrs gene could be the molecular cause of the resistance to injectable drugs. In this study we did not find any mutation in tlyA and gyrA/B associated to resistance. Conclusions. Our study suggests a possible association between the mutation A1401T in rrs and resistance to injectable drugs. However further studies should be done to confirm this hypothesis in Perú.

Key words: Drug resistance, multiple; Mycobacterium tuberculosis; Drug resistance, microbial (source: MeSH, NLM).

El aumento de la tuberculosis con resistencia a los antibióticos isoniazida y rifampicina, o multidrogorresistente (TB-MDR) y la tuberculosis extensamente resistente (TB-XDR) o resistente a isoniazida, rifampicina, y al menos a una fluoroquinolona y una droga antibiótica inyectable de segunda línea, amenaza los esfuerzos mundiales de control de la TB y es un problema de salud pública en varios países. En la región de las Américas, el Perú ocupa el cuarto lugar en incidencia de TB y el primer lugar en casos severos de TB-MDR ⁽¹⁾.

Aunque el Perú representa solo el 3% de la población de las Américas, el 12% de los pacientes con tuberculosis de la región y el 32% de los pacientes con TB-MDR residen en esta nación ⁽²⁾. Dentro del país, las tasas de TB-MDR se distribuyen heterogéneamente. Las zonas urbanas son las más afectadas, pues 59% de todos los casos de TB y 82% de los casos de TB-MDR son reportados en Lima. Los casos de TB-XDR también se concentran en Lima (93%) ⁽³⁾. El primer caso de TB-XDR fue notificado en 1999 y hasta el 2012 se han registrado 434 casos de TB-XDR, de los cuales 89,4% se encontraban en Lima y la provincia del Callao ⁽⁴⁾.

Las principales drogas bactericidas de segunda línea usadas en el tratamiento de TB pertenecen a los grupos de los inyectables y quinolonas. El primer grupo, conformado por aminoglicósidos y péptidos cíclicos, se conocen desde los 80, pero eran aplicados para el tratamiento de otras enfermedades infecciosas. En Perú, los aminoglicósidos kanamicina (Km) y amikacina (Am) ^(5,6), y el péptido capreomicina (Cm) ⁽⁷⁾ son usados actualmente en el tratamiento de TB-MDR. El grupo de las quinolonas se desarrolló entre las décadas de los 80 y 90 e incluyen compuestos de segunda, tercera y cuarta generación ⁽⁸⁾. En Perú, la ciprofloxacin (Cpx) y ofloxacina (Ofx) han sido las quinolonas de elección hasta el 2013 ⁽⁹⁾. Sin embargo, actualmente el Programa Nacional de Tuberculosis recomienda el uso de levofloxacina (Lfx), el isómero levógiro de la Ofx ^(10,11).

En 1991, con la implementación del DOTS (Directly Observed Therapy Short-course) en el Perú, se observó una disminución en la incidencia nacional de TB ⁽¹⁾. Desafortunadamente, el aumento de casos de TB-MDR y el acceso limitado a las pruebas de sensibilidad, dieron origen al tratamiento único (2RHZE/4R2H2) para todos los pacientes de TB; y posteriormente, en 1998, al tratamiento estandarizado para TB-MDR (2-4KmCxZEEtoCs/ Km2-3CxZEEto/ CxEtoCsZE*). Sin embargo, menos del 50% de los pacientes estaban curados al término del tratamiento y en aproximadamente el 30% se reportó falla al terapéutica ⁽⁴⁾.

Frente a esta realidad, es necesario investigar la resistencia de cepas multidrogorresistentes a las drogas de segunda línea, no solo a nivel clínico sino a nivel molecular ⁽¹²⁾. El objetivo de este estudio piloto fue determinar el patrón de resistencia a los aminoglicósidos y las quinolonas en cepas de Mycobacterium tuberculosis multidrogorresistentes.

POBLACIÓN

El presente estudio descriptivo fue parte de un ensayo clínico (fase III), realizado en el periodo enero de 2004 a diciembre de 2006, en el que se compararon cuatro métodos para la determinación de resistencia de M. tuberculosis a drogas de primera línea. Para este estudio piloto se seleccionaron las cepas multidrogorresistente aisladas de pacientes durante junio a diciembre de 2004 que se encontraban criopreservadas en el Banco de muestras del Instituto de Medicina Tropical "Alexander von Humboldt" (Lima, Perú).

CULTIVO

Las cepas descriopreservadas fueron sembradas en 500 uL de caldo 7H9 suplementado con OADC (Oleic Albumin Dextrose Catalase) e incubadas a 37 °C durante dos semanas. Luego, se hizo un aislamiento en medio Löwenstein-Jensen y se incubó a 37 °C durante dos semanas. A partir de estos cultivos se prepararon soluciones bacterianas de 1 mg/mL y se sembraron los tubos para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (Figura 1).

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)

La determinación de CMI se realizó en medio Löwenstein-Jensen13; kanamicina (Km: 7.5, 15, 30, 60, 120 μg/mL); amikacina (Am: 10, 20, 40, 80, 160 μg/ mL); capreomicina (Cm: 10, 20, 40, 80, 160 μg/mL); ciprofloxacina (Cpx: 1, 2, 4, 8 μg/mL); ofloxacina (Ofx: 0.5, 1, 2, 4, 8 μg/mL); gatifloxacina (Gfx: 0.25, 0.5, 1, 2, 4 μg/mL), y moxifloxacina (Mfx: 0.5, 1, 2, 4, 8 μg/mL) ⁽¹⁴⁾.

Las drogas de segunda línea se obtuvieron de Sigma-Aldrich (de Bornem, Bélgica) o Acros Organon (Geel, Bélgica). Todos los tubos se incubaron a 37 °C durante 28 días. La CMI se definió como la concentración más baja de fármaco que resulta en la inhibición del crecimiento o <1% del inóculo. La concentración de corte de resistencia se definió de acuerdo con las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS) ⁽¹⁵⁾ de la siguiente manera: Km - 30 μg/ml, Am - 40μg/ml, Cm – 40 μg/ml, Cpx - 2 μg/mL, Ofx – 2 μg/ mL, Gfx - 1 μg/mL y Mfx - 2 μg/mL.

AISLAMIENTO DEL ADN

Se tomaron colonias del tubo control con la ayuda de una asa de siembra de 10 uL y se resuspedieron en 500 uL de buffer TE 1X (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). Luego se incubaron a 95 °C durante 20 minutos para inactivar a las micobacterias. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 13 000 rpm durante 15 min y los sobrenadantes fueron almacenados a -20 °C para el posterior análisis de PCR.

ENSAYO DE PCR Y SECUENCIAMIENTO

Se usaron los siguientes sets de primers: KM-SA (5’-AAGTACCCCGCCTGGGGAG TACGG-3’) y KM-RA (5’-GGTGGGACAACACCTGGAACAAGTC-3’), para la amplificación de un fragmento de 831 pb que contenía la región 3´del gen rrs y parte de la región espaciadora adyacente (referida como "región 1400 rrs" a lo largo del texto); TlyA-SA(5’- CGACGTCGGTGGTGGTGCGGTA-3‘) y TlyA-RA (5’-GTCCGGTCTTCCACCCGGTAATCCT-3), se usó para la amplificación de la región del gen tlyA de 810 pb; y GyraseB-sense (5´-TAAGAGCGCCACCGACATCGGTGGATTG-3´) y GyraseA-reverse (5´GATGAAA TCGACTGTCTCCTCGTCGATTTCCC-3´) se usó para la amplificación del gen girasa de 1,231 bp ^(16,17).

El volumen final de reacción fue 50 μL y contenía 10 mM Tris-HCl (pH 8,6), 50 mM KCl, 1,65 mM MgCl2, 200 μM de cada uno de los cuatro deoxinucleótidos, 12,5 pmol de cada primer, 1,5 U de enzima Taq polimerasa (Promega, Madison, WI) y 2 μL del sobrenadante bacteriano inactivado. Se aplicaron las condiciones de PCR previamente descritas (Jugheli 2009) y se confirmó la presencia de productos en un gel de agarosa al 2%.

Los productos fueron secuenciados en el Departamento de Genética de la Universidad de Amberes (Bélgica) en un secuenciador por capilaridad (Applied Biosystems 3730). Se usaron los primers KMSEQ (5’-CTAGAGATAGGCGTTCCCTT GTGG -3’), TlyA-SEQ (5’-CGATCGCACGTCGTCTTTCCGA-3‘) y GyraseAB-Seq (5´-GTCGATTTCCCTCAGCATCTCCATC-3´) para secuenciar la hebra codante (contiene la información para la traducción de proteína) las regiones 1400 rrs, tlyA y gyrA/B, respectivamente. Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa CLC Sequence Vewer (versión 7.0.1). Las mutaciones en rrs, tlyA y gyrA/B fueron identificadas con NCBI BLAST y fueron comparadas con la secuencia "wild type" M. tuberculosis H37Rv.

CONSIDERACIONES ÉTICAS

El ensayo clínico del que se desprendió el presente estudio piloto fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Peruana Cayetano Heredia y del Instituto Nacional de Salud. Todos los pacientes enrolados firmaron un consentimiento informado y los datos se gestionaron de manera anónima.

RESULTADOS

Durante junio a diciembre de 2004 se procesaron 444 muestras de esputos provenientes de 444 pacientes que presentaron TB pulmonar diagnosticada por microscopia. Del total de muestras analizadas, 27 (6,1%) cepas aisladas fueron resistentes a isoniazida (H) y rifampicina (R), pero solo 18 (66,7%) fueron criopreservadas. Al descriopreservar y sembrar los cultivos secundarios se obtuvieron 14 (77,8%) cultivos positivos y 4 (22,2%) cultivos negativos. Finalmente, se realizó la determinación de la CMI a drogas de segunda línea en 14 cepas aisladas de pacientes que no habían recibido previamente tratamiento para TB-MDR (Figura 2).

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI)

Del total de analizados, 11 (78,6%) cepas sembradas para la determinación de la CMI tuvieron resultados válidos mientras que 3 (21,4%) cepas no presentaron crecimiento en los tubos controles invalidando los resultados. Cuatro (36,4%) cepas presentaron resistencia a todos los aminoglicósidos y la CMI fue >120 μg/mL para Km y >160 μg/mL para Am y Cm. Las siete (63,6%) cepas restantes fueron susceptibles a todos los aminoglicósidos y la CMI estuvo en un rango de 7,5 a 30 μg/mL para Km y en un rango de 10 a 40 μg/mL para Am y Cm. En el caso de las quinolonas se observó un rango de CMI bajo para todas las drogas (Gfx y Mfx, 0,25 μg/mL; Cx, 1-2 μg/mL; Ofx, 0.5-2 μg/mL) y solo dos cepas presentaron resistencia intermedia a Ofx (CMI = 4 μg/mL).

ASOCIACIÓN ENTRE LA RESISTENCIA IN VITRO Y MUTACIONES EN rrs, tlyA Y gyrA/B

Se secuenciaron en total 33 productos de PCR pertenecientes a 11 aislados diferentes y se observaron dos mutaciones en el gen tlyA (A33G, A750T), una mutación en el gen rrs (A1401G), 1 mutación en gyrA (T95(ACC)) y 1 mutación en gyrB (T695(ACC)). Las mutaciones A33G y A750T estuvieron presentes en todas las cepas (n = 11), sin embargo, no se observó asociación con la resistencia a aminoglicósidos. La mutación A1401G presente en el gen rrs se observó en 4/11 (36,4%) aislados y todas mostraron resistencia a los tres aminoglicósidos con CMI >120 μg/mL para Km y >160 μg/mL para Am y Cm. La mutación T695 (ACC) se observó en una sola cepa resistente, mientras que la mutación T95 (ACC) se observó en 5/11 cepas (Tabla 1).

DISCUSIÓN

En el presente estudio piloto se observó una baja resistencia a quinolonas, a pesar que la ciprofloxacina es la droga de elección para una variedad de infecciones en Perú. Sin embargo, la presencia de resistencia a inyectables genera preocupación debido a los altos valores de CMI que se observaron, sugiriendo que estos ya no serían adecuados para el tratamiento de casos de TB-MDR.

Las quinolonas son una familia de antibióticos de gran importancia en el manejo de muchas enfermedades comunitarias y nosocomiales. Debido al uso inadecuado de las quinolonas, han comenzado a presentarse resistencia de diversos gérmenes a estas ⁽¹⁸⁾. En la actualidad existe una gran variedad de fluoroquinolonas, las más usadas son Cpx, Ofx, Lfx, Mfx y Gfx.

A pesar que en el Perú se usan con frecuencia las quinolonas contra un amplio espectro de enfermedades infecciosas, en nuestro estudio piloto no se observó resistencia. En el Perú, la Cpx es la droga de elección para una variedad de infecciones, entre las cuales están la TB pulmonar ⁽¹⁹⁾. Estudios in vitro han demostrado que la Cpx tiene una baja actividad bactericida temprana contra M. tuberculosis y que se requeriría una dosis diaria mínima de 1000 mg, la cual es superior a la CMI de la Cpx (0,25-2 μg/mL) ^(20,21). Sin embargo, la baja resistencia que se observó podría deberse a que la micobacteria, al ser fagocitada por el macrófago, se mantendría protegida en el fagosoma, mientras que la Cpx se acumularía en el citoplasma de la célula ^(22,23). Además, Seral et al. también postularon la existencia de una bomba de flujo que eliminaría a la Cpx del citoplasma de las células reduciendo aun más las posibilidades de interacción entre la droga y la micobacteria.

Por otro lado, los inyectables son prescritos para el tratamiento de infecciones urinarias altas complicadas (pielonefritis aguda), sepsis (en combinación con otros antibióticos), endocarditis por Streptococcus viridans (junto con penicilina), entre otras infecciones. Tulkens et al. demostraron que los inyectables son fácilmente incorporados en fagocitos cuando las células están en contacto con estos durante períodos prolongados permitiendo que las micobacterias estén expuestas a ellos. Esto explicaría la resistencia observada en algunos aislados en este estudio piloto ⁽²⁴⁾.

El mecanismo molecular para la mayoría de las drogas de segunda línea usadas en TB es conocido ⁽²⁵⁾. La resistencia a inyectables como Am, Km y Cm estaría asociada a mutaciones en el gen rrs de la región 16S rRNA, específicamente entre los nucleótidos 1400-1500 ⁽²⁶⁾ . En el caso de la capreomicina se postula además que la resistencia también podría estar asociada a mutaciones en el gen tlyA que codifica la 2-O-metiltransferesa ⁽²⁷⁾. Por su parte, las quinolonas tienen como blanco la enzima topoisomerasa II (ADN girasa) codificada por los genes gyrA y gyrB. Mutaciones en dos regiones de estos genes (A90, D94, A74, G88, S91, N533), conocidas como regiones determinantes de resistencia a quinolonas, estarían asociadas a la resistencia a las principales quinolonas ^(17,28).

Con el fin de entender el mecanismo molecular de la resistencia, se deben descartar las mutaciones que no confieren resistencia a los inyectables y quinolonas. En este estudio piloto, las mutaciones A33G y A750T en el gen tlyA estuvieron presentes en todos los aislados (resistentes y sensibles), y no presentaron asociación con resistencia a ningún aminoglucósido. Así mismo, las mutaciones presentes en los genes gyrA y gyrB asociadas a los codones T95 y T695, no presentaron asociación con resistencia a ninguna quinolona.

Estudios previos han demostrado que la mutación G1484T en el gen rrs está asociada con la resistencia a Km, Am y Cm29. Además, Maus et al. demostraron que algunas mutaciones en el gen tlyA conferían resistencia a Cm. En el presente estudio ninguno de los aislados analizados presentó alguna de estas mutaciones. Sin embargo, las mutaciones previamente reportadas en el gen tlyA fueron encontradas en mutantes generadas en el laboratorio pero en ninguno de los aislados clínicos analizados ⁽²⁷⁾.

La correlación entre la mutación A1401T en el gen rrs y la resistencia a los tres inyectables que se observó en nuestro estudio fue más clara y fuerte en comparación a los últimos datos reportados ^(27,29). Aunque este resultado puede estar sesgado por el amplio uso indebido de Km y Am en el Perú, es posible que aun represente una realidad en todo el mundo, y por lo tanto la mutación A1401G podría ser la causa principal de resistencia clínicamente significativa in vivo. Además, el método molecular GenoType MTBDRsl (Hain Lifescience, Nehren, Alemania) ⁽³⁰⁾, actualmente utilizado en el Instituto Nacional de Salud, contiene la mutación A1401T en su panel de detección ⁽¹¹⁾.

El presente estudio presentó las siguientes limitaciones: la selección de cepas MDR, el período relativamente corto de siete meses de recolección de muestras, y la falta de representatividad del número de muestras.

Se concluye que los resultados obtenidos sugieren una baja resistencia a quinolonas y la posibilidad de continuar su uso de manera segura para el tratamiento de TB-XDR. Además, sugiere una posible asociación entre la mutación en A1401G y la resistencia a inyectables en cepas MDR. Recomendamos realizar estudios futuros abarcando un período mayor e incluir cepas sensibles y multidrogorresistentes para poder dilucidar las mutaciones que realmente estarían asociadas con la resistencia a inyectables.

Agradecimientos: A nuestras trabajadoras de campo por la recolección de datos y muestras; y al personal de los centros de salud por su apoyo continúo en la conducción del estudio.

Fuentes de financiamiento: Este estudio fue financiado por la Dirección General de Cooperación Belga para el Desarrollo (DGDC) a través de una colaboración institucional entre el Instituto de Medicina Tropical de Amberes, Bélgica y el Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt en Lima, Perú.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflictos de interés.

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Correspondencia:
Francesca Barletta Solari
Dirección: Universidad Peruana Cayetano Heredia. Av. Honorio Delgado Nº340, San Martin de Porres.
Teléfono: 482 3903 anexo 20
Correo electrónico: francescabarletta@yahoo.es

Recibido: 21-04-14
Aprobado: 15-10-14