Original Breve

Identificación de células proliferativas en quistes de Taenia solium

Identification of proliferating cells in Taenia solium cysts

Miguel Ángel Orrego-Solano^1,a, Carla Cangalaya^1,b, Theodore E. Nash^1,2,c, Cristina Guerra-Giraldez^1,3,d, Grupo de Trabajo en Cisticercosis en Perú (CWGP)

¹ Laboratorio de Inmunopatología en Neurocisticercosis, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.
² Laboratory of Parasitic Diseases, National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, EE. UU.
³ Departamento de Ciencias Celulares y Moleculares, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.
^a Biólogo; ^b tecnóloga médica; ^c médico cirujano; ^d doctora en biología molecular.

Se presentan resultados preliminares que se ampliarán para una Tesis de Maestría en Bioquímica y Biología Molecular.

Los neoblastos son células totipotentes, únicas responsables de la proliferación y maduración de tejidos en platelmintos de vida libre. Células similares se han aislado en platelmintos parásitos como Echinococcus. Taenia solium causa la teniasis humana (intestinal) y la cisticercosis en humanos y cerdos. La infección del cerebro con larvas (quistes) de T. solium resulta en neurocisticercosis, hiperendémica en el Perú; su tratamiento se asocia a síntomas neurológicos graves. La capacidad proliferativa y el desarrollo de los estadios de T. solium aún no se describen, y no se ha caracterizado los neoblastos de este parásito. Se buscó células proliferativas en quistes de T. solium colectados de un cerdo infectado, que fueron identificadas al replicarse e incorporar el nucleótido bromodesoxiuridina, detectado con un anticuerpo monoclonal. Una línea celular estable de neoblastos sería útil para estudios sistemáticos in vitro sobre eficacia de drogas y sobre la biología de T. solium.

Palabras clave: Parasitología; Taenia solium; In vitro; Proliferación celular (fuente: DeCS BIREME).

Neoblasts are totipotent cells, solely responsible for the proliferation and maturation of tissues in free-living flatworms. Similar cells have been isolated from parasitic flatworms such as Echinococcus. Taenia solium causes human taeniasis (intestinal) and cysticercosis in humans and pigs. Brain infection with larvae (cysts) of T. solium results in neurocysticercosis which is hyperendemic in Peru, and its treatment is associated with serious neurological symptoms. The proliferative capacity and development stages of T. solium have not been described and the neoblasts of this parasite have not been characterized We looked for cell proliferation in T. solium cysts collected from an infected pig, which were identified when replicating and incorporating bromodeoxyuridine nucleotide detected with a monoclonal antibody. A stable cell line of neoblasts would be useful for systematic in vitro studies on drug efficacy and the biology of T. solium.

Key words: Parasitology; Taenia solium; In vitro; Cell proliferation (source: MeSH, NLM).

La neurocisticercosis (NCC) es la enfermedad parasitaria más frecuente del sistema nervioso central; es causada por la invasión al cerebro del metacestodo, larva cisticerco o quiste de T. solium. Es endémica en varios países de América Latina, África e India. En el Perú existen zonas rurales y suburbanas hiperendémicas, donde se reporta que el 40% de casos de epilepsia está asociado a la NCC ⁽¹⁾. Los quistes son vesículas con fluido, de entre 1 y 2 cm, que se desarrollan a partir de embriones (oncósferas) presentes en los huevos microscópicos desechados en las heces de una persona con teniasis. Esta ocurre con el consumo de carne de cerdo infectado con quistes de T. solium. Al ingerirse el quiste, el escólex del gusano evagina de la vesícula y se adhiere al intestino. Las células del cuello proliferan y se diferencian para dar lugar a los segmentos o proglótidas que al madurar producen millones de huevos ⁽¹⁾.

Las manifestaciones de la NCC son variadas, pues dependen del número de quistes, su ubicación, la respuesta inmune asociada y el desarrollo del parásito en el cerebro. Los ataques epilépticos son causados por la respuesta inflamatoria a la degeneración y muerte de quistes parenquimales, que ocurren principalmente por el uso de antihelmínticos ⁽²⁾. Los quistes llamados racemosos son de crecimiento aberrante y proliferación continua, y se vinculan a alta mortalidad por despertar una fuerte reacción inflamatoria que causa aracnoiditis, hidrocefalia, infartos y daño neurológico focalizado ⁽³⁾.

Los platelmintos de vida libre sirven como modelo para estudiar la biología de las células madre totipotentes llamadas neoblastos, capaces de diferenciarse en cualquier tipo de célula somática ⁽⁴⁾. Los neoblastos se consideran las únicas células mitóticamente activas de estos organismos ⁽⁵⁾ y se investigan intensamente por sus posibles aplicaciones en la medicina regenerativa ^(5,6). Se ha identificado marcadores moleculares asociados con la proliferación en las planarias D. japonica y Schmidtea mediterranea y se ha descrito su perfil de transcripción ⁽⁶⁾.

Las propiedades de este tipo de células en los platelmintos de la clase Cestoda, a la que pertenece Taenia, son mucho más elusivas; su estudio se dificulta porque al ser organismos parásitos, su crecimiento es afectado por factores hormonales e inmunológicos de sus hospederos. Recientemente, el crecimiento in vitro de quistes del cestodo Echinococcus multilocularis permitió aislar células germinales capaces de diferenciarse hasta la forma larvaria ^(7,8). Estas células indiferenciadas forman parte de las oncósferas y se postula que contribuyen al desarrollo del metacestodo ^(8,9). En este organismo se ha verificado que las células germinativas son las únicas que proliferan ⁽¹⁰⁾, y algunos autores deciden llamarlas neoblastos por ser células madre somáticas totipotentes ^(11,12). Debe notarse, sin embargo, que en platelmintos parásitos existen ciertas diferencias a nivel molecular con las células proliferativas de las planarias ⁽¹⁰⁾. Los neoblastos de diferentes especies tienen una morfología característica: se trata de células con núcleos muy grandes y escaso citoplasma ^(4,13,14).

La disponibilidad de células totipotentes de T. solium posibilitaría el ensayo in vitro de sustancias cisticidas con menos efectos secundarios que los antihelmínticos actualmente empleados, como se está haciendo con Echinococcus ⁽¹⁵⁾; también puede pensarse en estudios funcionales de la relación hospedero-parásito relacionados con el desarrollo y proliferación, o incluso manipulación genética y generación de recombinantes ^(11,15). Este trabajo se realizó para identificar células de T. solium similares a neoblastos en quistes provenientes de cerdos infectados; se propone su aislamiento y purificación para obtener una línea celular estable, útil en diversas aplicaciones y estudios.

Se describe la estrategia para identificar células proliferativas en quistes de Taenia solium . El método, empleado en planarias ⁽¹⁶⁾, consiste en cultivar los quistes en presencia del nucleótido modificado 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU), análogo de la timidina, el cual es incorporado en el ADN de las células que se replican. El BrdU captado por las células se detectó por inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal. En paralelo, se indujo la evaginación de otro grupo de quistes para hacer la misma búsqueda en el estadio preadulto del parásito.

Se trabajó con 250 quistes musculares viables de T. solium colectados de un cerdo hembra perteneciente al estudio "Eliminación de cisticercosis en Perú", del Centro de Salud Global UPCH, Tumbes, con autorización del Comité Institucional de Ética para Animales de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (SIDISI 03101).

La infección del animal se corroboró por inmunoblot contra glicoproteínas de T. solium purificadas con lectinas de lenteja (EITB LLGP) ⁽¹⁷⁾.

Los quistes se lavaron seis veces con solución tampón fosfato salino, pH 7,2 (PBS) con antibióticos (80 µg/mL de gentamicina y 100 U/mL de penicilina, ambas de Gibco, Gaithersburg, MD, EE.UU.), y se estabilizaron 24 h en cultivo a 37 °C con CO₂ al 5% en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con tampón HEPES 10 mM (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y antibióticos (100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 0,25 µg/mL de anfotericina B).

Aproximadamente 100 quistes se transfirieron a una placa de 12 pozos, entre 6 y 8 quistes por pozo, para incubarlos hasta cinco días a 37 °C con CO₂ al 5% y en presencia de BrdU (Sigma), en concentraciones de 0; 1; 2,5 y 5 mM en el medio de cultivo (2 mL/pozo). Cada 24 h, hasta las 120 h, se tomó una muestra de 3 o 4 quistes de cada grupo, que se fijaron con formalina al 10% (formaldehído al 3,7% en PBS) para la detección de BrdU por inmunohistoquímica.

Una placa de quistes similar se cultivó en medio con BrdU 0; 2,5 y 5 mM por 3 días, al cabo de los cuales se reemplazó 1 mL del medio por 1 mL de bilis porcina al 50% (en el mismo medio), a fin de inducir la evaginación de los parásitos. Muestras de 3 o 4 quistes se colectaron a los 30 min, 1 h, 5 h, 12 h, 24 h y 48 h de agregada la bilis, y se fijaron con formalina al 10%.

Las muestras fijadas se incluyeron en bloques de parafina, y secciones de 4 µm se montaron en láminas revestidas con poli-L-lisina. Para la tinción por inmunohistoquímica, la parafina se disolvió a 56 °C y se retiró mediante un pasaje de 5 min con xileno, seguido por pasajes en un gradiente descendente de etanol (del 100 al 70%) y uno último con agua destilada, para hidratar las láminas. Por último, se las dejó 30 min en peróxido de hidrógeno al 6%, a temperatura ambiente.

La recuperación de antígeno se realizó por 30 min a 95 °C en buffer citrato (citrato de sodio 10 mM en Tween-20 al 0,05%). Antes de la detección se bloqueó las láminas por 30 min a temperatura ambiente en una cámara húmeda con suero de cabra al 2%, albúmina sérica bovina al 2%, leche desgrasada al 2%, Tween-20 al 0,05% y Triton X-100 al 0,1% en PBS. Finalmente, las láminas se expusieron 18 h, a 4 °C, a anti-BrdU de ratón (Sigma), en diluciones 1:500, 1:1000 y 1:2000 en PBS. Se empleó un anticuerpo biotinilado, IgG antirratón hecho en cabra (Vector, Burlingame, CA, EEUU), incubado a temperatura ambiente por 30 min.

El cromógeno 3,3’-diaminobenzidina (DAB; Dako, Dinamarca) se detectó con estreptavidina conjugada a peroxidasa (Dako), que resulta en un precipitado de color marrón característico cuando hay reacción positiva. Los lavados entre incubaciones se hicieron con Tween-20 al 0,05% en PBS. Las láminas se observaron en un microscopio Primo Star (Zeiss, Alemania) y se fotografiaron con una cámara calibrada (AxioCam ICc1, Zeiss, Alemania).

El estudio permitió determinar que la concentración óptima de BrdU para observar células que incorporaron esta molécula fue 1 mM; concentraciones superiores mostraron ruido de fondo. También se determinó que la mejor dilución de anti-BrdU para la detección fue 1:2000; a 1:1000 y 1:500 se obtuvo ruido de fondo. Las Tablas 1 y 2 resumen las observaciones.

Entre los quistes cultivados cinco días, la primera muestra para inmunohistoquímica se tomó a las 24 h de agregado el BrdU; como control se usó una muestra cultivada el mismo tiempo pero sin BrdU. La Figura 1 muestra, a 4X (1A; permite observar la morfología del quiste) 10X (1B), 40X (1C) y 100X (1D), que ya desde el primer día de cultivo eran visibles células marcadas (patrón punteado marrón) de 7-10 mm, con núcleos muy prominentes (Figura 1D). A 48, 72, 96 y 120 h las observaciones fueron similares.

Un número muy superior de células marcadas se detectó en quistes inducidos a evaginar luego de tres días de cultivo en BrdU 2.5 mM. La Figura 2, con los mismos aumentos que la Figura 1, muestra abundantes células en proliferación en la región parenquimal de las zonas laterales del escólex, morfología evidente en 2A. La muestra se tomó 1 h después de agregada la bilis porcina. Puntos de tiempo posteriores (6, 12, 24 y 48 h) tuvieron progresivamente menos células proliferativas. Entre las células marcadas fue posible ver algunas en las que los núcleos, siempre de gran tamaño, ya mostraban indicios de separarse en dos masas (Figura. 2D).

Este trabajo consiste en la búsqueda de posibles neoblastos de Taenia solium, mediante la identificación de células proliferativas por la incorporación del análogo de timidina, bromodesoxiuridina (BrdU); este método se ha empleado para marcar neoblastos en planarias ⁽¹⁶⁾. En estos organismos, los neoblastos son las únicas células capaces de proliferar y diferenciarse. En el caso de T. solium, la incubación con BrdU permitió identificar células en replicación en el estadio larvario (quiste o metacestodo) y también en la fase preadulta, obtenida al inducir la evaginación in vitro de los quistes.

Aunque el papel de los neoblastos en la regeneración de las planarias se estudia desde los años 40 ⁽⁵⁾, la descripción de tejidos germinales en cestodos fue recién posible por estudios hechos en los años 70 en Hymenolepis adultos ⁽¹³⁾ . Más adelante, en 1997, se identificaron las células de la región germinativa de Taenia solium ("células madre somáticas") presentes en quistes evaginados in vitro ⁽¹⁴⁾, y posteriormente se ha demostrado mitosis en tejido germinal de T. solium en fase adulta temprana, gusanos "juveniles" recuperados de los intestinos de hamsters a los que se había inoculado quistes viables ⁽¹⁸⁾.

En los últimos años ha habido un gran avance en el aislamiento, caracterización y establecimiento de una línea celular de Echinococcus ^(7-11), pero la literatura sobre neoblastos o tejido germinal de Taenia es escasa. El presente trabajo detecta células proliferativas en quistes no evaginados de T. solium, de los cuales no se encuentra registro previo.

En quistes viables, células con morfología de neoblastos (Figura 1D), descrita en planarias y cestodos ^(4,13,14), fueron claramente visibles a las 24 h de cultivo con BrdU (Figura 1), lo que indica que habían replicado su ADN. En quistes evaginados se observó una marcada proliferación de estas células una hora luego de inducir la evaginación (Figura 2), con una distribución que recuerda la reportada en el mismo estadio ("preadulto"), detectado con timidina tritiada ⁽¹⁴⁾.

El marcado y la morfología son complementarios. Las células marcadas se distribuyen en la base del escólex, y su morfología permite proponerlas como neoblastos.

Si esto se verifica, se intentará aislar estas células para establecer una línea celular como la existente para Echinococcus. El aislamiento de neoblastos mediante digestión con proteasas y cocultivo con células de mamífero ha sido ya posible a partir de quistes de T. crassiceps ⁽¹⁹⁾, y se está empleando citometría de flujo para aislar y cuantificar neoblastos de Mesocestoides corti, otro cestodo ampliamente usado en cultivo ⁽²⁰⁾.

Además de la posibilidad de realizar estudios de sensibilidad a drogas y determinación de nuevos principios antihelmínticos, es atractivo establecer líneas celulares de T. solium para facilitar análisis de expresión genética o perfiles de transcripción en aspectos del desarrollo (marcadores moleculares específicos de los diferentes estadios), de la relación hospedero-parásito, como señalización y virulencia, o de la ruta inflamatoria en cerebro, de conocimiento bastante limitado.

Agradecimientos: agradecemos a Gissel Ocampo, Ricardo Gamboa, Viterbo Ayvar y Luz María Moyano, del laboratorio del Centro de Salud Global UPCH (Tumbes) por proporcionar quistes de T. solium.

Fuente de financiamiento: subvención Fincyt (Concytec) a investigación básica; PIBA-1-P-4453-13.

Conflictos de interés: los autores declaran no tener conflictos de interés.

Contribuciones de autoría: TEN concibió el trabajo; MAO y CGL procesaron muestras; MAO y CGG obtuvieron financiamiento, diseñaron el estudio y el artículo, analizaron los resultados, redactaron el artículo y aprobaron su versión final.

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Correspondencia:
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Recibido: 03-05-14
Aprobado: 24-09-14