10.17843/rpmesp.2020.373.4465
ARTÍCULO ORIGINAL

Efecto inhibitorio in vitro de la ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada frente a Leishmania (Viannia) peruviana Y Leishmania (Viannia) braziliensis

In vitro inhibitory effect of aluminum phthalocyanine tetrasulfonate chloride against Leishmania (Viannia) Peruviana and Leishmania (Viannia) Braziliensis

Kelly Vanessa Izarra-Rojas ¹, Bióloga/o
Nyshon Rojas-Palomino ², Bióloga/o
José Luis Gonzales-Medrano ⁴, químico
Gloria Minaya-Gómez ², bióloga, máster en Medicina Tropical y Salud Internacional
Alfredo Berrocal-Huallpa ³, biólogo, magister en Mejoramiento Genético de Plantas
Julio Santiago-Contreras ⁴, químico, doctor en Química
Jorge León-Quispe ¹, biólogo, magíster en Ciencias Microbiológicas

¹ Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
² Laboratorio de Referencia Nacional de Leishmaniasis, Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú.
³ Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma de Ica, Perú.
⁴ Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Química Orgánica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.

El presente estudio forma parte de la tesis: Izarra Rojas KV. Actividad fotodinámica in vitro de ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada (AlPcClS4) frente a estadios extracelular e intracelular de Leishmania (Viannia) peruviana, L. (V.) braziliensisy L. (Leishmania) amazonensis,[Tesis]. Lima: Universidad Nacional Mayor de San Marcos; 2018.

RESUMEN

Objetivos: Evaluar la actividad fotodinámica in vitro de la ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada (AlPcClS₄) sobre promastigotes y amastigotes de Leishmania (Viannia) peruviana y Leishmania (Viannia) braziliensis.

Materiales y métodos: La actividad del tratamiento fotodinámico empleando AlPcClS₄ sobre promastigotes y amastigotes de Leishmania fue determinada mediante el método colorimétrico Metil Tiazol Tetrazolium (MTT) y PCR cuantitativo, respectivamente.

Resultados: El tratamiento fotodinámico presentó un efecto inhibitorio sobre promastigotes, principalmente sobre Leishmania (V.) peruviana, en menor proporción sobre Leishmania (V.) braziliensis y sobre las formas intracelulares de ambas especies. En Leishmania (V.) peruviana, a las 24 horas posirradiación a 200 µM y 350 µM el efecto inhibitorio fue del 72,9% y 73,9%, respectivamente y a las 96 horas fue del 78,8% y 80,6%, respectivamente. En las formas intracelulares, empleando 200 µM y evaluado a las 72 horas postratamiento, se observó una inhibición del 57,8% de amastigotes de Leishmania (V.) peruviana. El IC₅₀ fue del 56,5; 50; 44; y 39,7 µM, que corresponde a las 24, 48, 72 y 96 horas posirradiación, respectivamente.

Conclusiones: El tratamiento fotodinámico empleando AlPcClS₄ frente a las especies de Leishmania presentó resultados alentadores principalmente sobre Leishmania (V.) peruviana, lo cual sugiere su potencial uso como alternativa o complemento del tratamiento convencional de la leishmaniasis tegumentaria. Sin embargo, aún se requiere continuar con nuevos ensayos para determinar el índice de selectividad sobre el parásito en su forma intracelular, y desarrollar estrategias que faciliten el ingreso eficiente de la molécula hacia la célula hospedera y al parásito.

Palabras clave: Enfermedades tropicales; Leishmaniasis Cutánea; Terapia Fotodinámica; Fotosensibilizadores; Tratamiento Alternativo (fuente: DeCS BIREME).

ABSTRACT

Objectives: To evaluate the in vitro photodynamic activity of aluminum phthalocyanine tetrasulfonate chloride (AlPcClS₄) on promastigotes and amastigotes of Leishmania (Viannia) peruviana and Leishmania (Viannia) braziliensis.

Materials and methods: The activity of photodynamic therapy using AlPcClS₄ on Leishmania promastigote and amastigotes was determined by the Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) colorimetric method and quantitative PCR, respectively.

Results: Photodynamic treatment showed an inhibitory effect on promastigotes, particularly on Leishmania (V.) peruviana, to a lesser extent on Leishmania (V.) braziliensis and also on intracellular forms of both species. At 24 hours post-radiation, using concentrations of 200 μM and 350 μM, the inhibitory effect on Leishmania (V.) peruviana was 72.9% and 73.9% respectively; at 96 hours the inhibitory effect was of 78.8% and 80.6%, respectively. Regarding intracellular forms, the inhibitory effect on Leishmania (V.) peruviana amastigotes was 57.8% at 72 hours post-treatment, using a concentration of 200 μM. The IC₅₀ was 56.5, 50, 44 and 39.7 μM, at 24, 48, 72 and 96 hours post-radiation, respectively.

Conclusions: Photodynamic therapy using AlPcClS4 against Leishmania species showed encouraging results, mainly on Leishmania (V.) peruviana, suggesting a potential use as an alternative or complement to the usual treatment of tegumentary leishmaniasis. However, new trials are still required to determine the selectivity index for the intracellular form of the parasite, and to develop methods to facilitate the efficient entry of the molecule into the host cell and the parasite.

Keywords: Tropical Diseases; Cutaneous Leishmaniasis; Photodynamic Therapy Photosensitizers; Alternative Treatment (source: MeSH NLM).

INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis es una enfermedad metaxénica causada por un protozoario del género Leishmania;en las Américas, es transmitido por un flebotomino del género Lutzomyia conocido como «manta blanca» o «titira» a mamíferos, entre ellos, el ser humano ⁽¹⁾. Según la especie de Leishmania infectante y el sistema inmune del hospedero, esta enfermedad puede, además de presentar lesiones ulcerativas, desarrollar metástasis en las mucosas e incluso causar daño en el hígado, bazo y páncreas, que al no tratarse oportunamente pueden producir la muerte del paciente ⁽²⁾.

En el Perú, el Ministerio de Salud reportó en el 2018 un total de 5808 casos de leishmaniasis tegumentaria, de los cuales el 94% y 6% representan casos cutáneos y cutáneos mucosos, respectivamente, causados principalmente por Leishmania (Viannia) peruviana, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis y Leishmania (Leishmania) amazonensis; otras formas clínicas inusuales reportadas en nuestro país son la leishmaniasis cutánea diseminada causada por especies como Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (L.) amazonensis y la leishmaniasis cutánea difusa causada por la infección con Leishmania (L.) amazonensis; por otro lado, en el Perú no hay reportes de casos con leishmaniasis visceral, cuya forma clínica es letal si no es detectada oportunamente.

El tratamiento de primera línea para todas las especies de Leishmania son los antimoniales pentavalentes, mientras que el tratamiento con anfotericina B se corresponde con la segunda línea; ambos son administrados por vía parenteral en prolongadas sesiones. Debido a la naturaleza de estos medicamentos, su empleo provoca efectos adversos, como náuseas, vómitos, mialgias, efectos nefrotóxicos, entre otros, que podrían generar casos de abandono al tratamiento e incrementar el reporte de fallas terapéuticas debido a la administración de dosis incompletas o inadecuadas, además su empleo no es recomendado en mujeres embarazadas ni en pacientes con arritmias cardiacas ^(3-5). Asimismo, la miltefosina empleada como tratamiento por vía oral y recomendado por la Organización Mundial de la Salud también presenta efectos colaterales, además de elevar el costo del tratamiento de la enfermedad ^(5,6). Estas limitaciones han estimulado la búsqueda de alternativas terapéuticas más eficaces y con menos efectos colaterales.

La terapia fotodinámica (TFD) ha demostrado que puede inducir la muerte celular por apoptosis y necrosis mediada por el oxígeno singulete y radicales tóxicos (especies reactivas de oxígeno) de alta reactividad producidos por la interacción del agente fotosensibilizador, una longitud de onda específica y oxígeno molecular ⁽⁷⁾, características que lo convierten en una potencial alternativa para el tratamiento de enfermedades infecciosas, entre ellas, la leishmaniasis ^(8-10). El presente estudio tiene el objetivo de evaluar in vitro el efecto de un nuevo fotosensibilizador frente a los estadios de promastigotes y amastigotes de Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis, especies de importancia epidemiológica en la salud pública del Perú.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente estudio de diseño descriptivo observacional se desarrolló en los laboratorios de Ecología Microbiana (Facultad de Ciencias Biológicas) y de Química Orgánica (Facultad de Química) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, y en el Laboratorio de Referencia Nacional de Leishmaniasis del Instituto Nacional de Salud (INS) del Perú.

Línea celular macrófagos y promastigotes

Los ensayos en líneas celulares se desarrollaron en placas de 24 pocillos (Corning, Costar Cat. COR-3524), a los que se le agregó una laminilla circular en la base. La línea celular de macrófago de canes DH82 fue proporcionada por el Laboratorio de Cultivo Celular del INS, cultivada en un medio mínimo esencial (MEM) (Gibco Cat. 61100-061), suplementada con suero fetal bovino inactivado (SFBi) (Gibco, Cat. 1079255) al 15% y antibióticos (Gibco, Cat. 15240-062), incubada a 37 °C, 5% de CO₂ y mantenida por repiques sucesivos cada 72 horas.

Asimismo, se emplearon cultivos de cepas de Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis, criopreservados a - 70 ± 5 °C. Para su reactivación, las cepas de Leishmania fueron descongeladas e inmediatamente llevadas a un medio bifásico en agar sangre con 15% de sangre de conejo, luego a medio líquido Schneider’s Drosophila a un pH de 6,65-6,75 (Gibco, Cat. 21720024) suplementado al 20% con SFBi ^(11,12), más 150 µg/ml de gentamicina e incubadas a 24 ± 1 °C, con la finalidad de obtener mayor masa parasitaria. Las cepas reactivadas se mantuvieron en medio Schneider’s al 10% con SFBi. El proceso de infección in vitro en macrófagos se desarrolló con promastigotes metacíclicos obtenidos por inducción a un pH ácido de 5,5 con 10% de SFBi y antibióticos.

El proceso de infección de macrófagos tuvo lugar en placas de 24 pocillos de 1 × 10⁵ macrófagos/ml, en MEM con SFBi al 15%, e incubados a 37 °C y 5% de CO₂ por 15 horas. Se agregaron promastigotes metacíclicos en una proporción 20:1 (parásito:macrófago) y se incubaron a 33 °C y 5% de CO₂ por 5 horas. Finalmente, se realizaron tres lavados con MEM al 2% y con SFBi para eliminar los parásitos no fagocitados.

Evaluación de la actividad inhibitoria

Se preparó una solución del fotosensibilizador ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada (AlPcClS4) (Frontier Scientic) a una concentración inicial de 1 mM más 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Applichem) en solución tampón fosfato salino (PBS) a un pH de 7,4 y filtrado a 0,45 µm.

Para determinar la concentración inhibitoria media (IC₅₀) de la AlPcClS₄, se desarrollaron dos ensayos independientes , cada uno de ellos por triplicado; en promastigotes, se evaluaron a las concentraciones de 0; 25; 50; 75; 100; 200 y 350 μM del compuesto en 3 ml de medio líquido con 5 × 10⁵ parásitos (T₀) e incubados durante 24 horas a 26 °C y en oscuridad. Al término, se irradió por única vez luz LED a longitud de onda específica de 675 nm, 30 J/s*m² de potencia y a una distancia de 10 cm por 30 minutos, el cual permitió una potencia de irradiación aproximada de 5,4 J/cm². Asimismo, el efecto inhibitorio de la TFD con ftalocianina sobre los promastigotes de Leishmania a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas fue determinado indirectamente mediante el ensayo colorimétrico de MTT (Metil Tiazol Tetrazolium) ⁽¹³⁾.

En amastigotes intracelulares, luego del proceso de infección y lavado, se adicionó 1 ml de MEM con SFBi al 15% y la AlPcClS₄ a una concentración final de 50, 75, 100 y 200 µM, se incubaron las muestras por 24 horas a 37 °C y 5% de CO₂. Al término se irradió con luz LED y volvieron a incubarse por 72 horas posirradiación, el efecto del compuesto sobre las formas amastigotes fue determinado por PCR cuantitativo.

Se evaluó de manera independiente el efecto de la AlPcClS₄ sin exposición a la luz y viceversa. Asimismo, se emplearon promastigotes y macrófagos DH82 como control de crecimiento y estibogluconato (Pentostam) a concentraciones de 100, 200 y 2 × 10⁴ μM para los ensayos con promastigotes y a 200 μM para los amastigotes intracelulares, además se usó tritón al 0,01% como control de tratamiento.

Ensayo colorimétrico de MTT

El método colorimétrico de MTT se desarrolló según la metodología de descrita por Mesa et al. ⁽¹⁴⁾ con las siguientes modificaciones: se colectaron en tubos cónicos estériles de 1,5 ml los promastigotes tratados a distintas concentraciones de ftalocianina e irradiados; los parásitos fueron centrifugados a 3500 rpm; se descartó cuidadamente el sobrenadante; luego se agregó 450 μl de medio líquido y 50 μl de MTT (5 mg/ml), y se incubaron por 4 horas a 32 °C. Finalmente, para detener la formación de los cristales de formazán se agregó a los pocillos una solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10%, HCl 0,01 N ⁽¹⁴⁾. Las muestras se leyeron a una absorbancia de 570 nm en el espectrofotómetro de microplacas Eon (Biotek).

Extracción de ADN y cuantificación de la carga parasitaria

Los macrófagos infectados y tratados, 72 horas posirradiación, fueron lavados con PBS estéril a un pH de 7,2 para retirar re­manente del medio de cultivo y extracción del ADN. Se agregó 100 μl de tripsina-EDTA al pocillo y se incubó por 10 minutos para desprender las células de las laminillas. Luego se adicionó 100 μl de PBS, se colectó la suspensión de células y se puso en tubos cónicos de 1,5 ml para extraer ácidos nucleicos, lo cual se realizó empleando PureLink ® Genomic DNA Kit (Invitrogen, Cat. K1820-02), las muestras fueron eluídas en volumen final de 60 μl.

La medición del efecto inhibitorio del tratamiento fotodinámico en macrófagos infectados fue realizado mediante la cuantificación de la carga parasitaria por qPCR ^(15,16). Se emplearon los oligonucleótidos Leis.L1 5’-GACGCACTAAACCCCTCCAA-3’ y Leis.U1 5’-AAGTGCTTTCCCATCGCAACT-3’ como iniciadores del PCR, y Leis.P1 FAM 5’-CGGTTCGGTGTGTGGCGCC-3’ TAMRA como sonda marcada; la metodología se describe en Wortmann et al. ⁽¹⁵⁾.

Brevemente, se elaboró la curva estándar con ADN genómico de Leishmania (V.) braziliensis a una concentración de 415,75 ng equivalente a 5 × 10⁶ parásitos/µl (120 parásitos = 10 pg de ADN) y diluciones equivalentes a 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10, 10^-1 parásitos_. El volumen final de la reacción fue de 20 µl, constituido 1X de Kapa Probe Fast qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, Cat. KK4701), 0,2 µmol/µl de cada cebador, 0,04 µmol/µl de sonda y 5 µl de ADN de las muestras. Se amplificó el ADN mediante una denaturación inicial de 95 °C por 30 segundos para activar la enzima, seguido de 40 repeticiones de denaturación a 95 °C por 30 segundos y una hibridización/extensión a 60 °C por 30 segundos.

Análisis estadístico

Se determinó la media y la desviación estándar de los resultados con Microsoft Excel 2010. Asimismo, se calculó el porcentaje de inhibición a partir de las densidades ópticas encontradas en el ensayo de MTT, empleando la fórmula ⁽¹⁷⁾:

Adicionalmente, se realizó el gráfico de QQ plot y la prueba de Shapiro Wilk para evaluar la normalidad y la homogeneidad de los valores residuales de los datos empleando el gráfico de dispersión. Se compararon las medias de la TFD según las concentraciones de 0, 25, 50, 75, 100, 200 y 350 µM de AlPcClS₄ sobre Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis empleando ANOVA y la prueba de Tukey, con un α = 0,05. Asimismo, se determinó la IC₅₀ frente a promastigotes de Leishmania.

Criterios éticos

El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud del Perú con RD N.o 397-2016-OGI­TT-OPE/INS.

RESULTADOS

Mediante el ensayo MTT, se cuantificó el efecto de la TFD sobre Leishmania. Para Leishmania (V.) peruviana, el tratamien­to control presentó una DO₅₇₀ de 0,27 ± 0,04; para 100 µM presentó una DO₅₇₀ de 0,22 ± 0,05, para 200 µM presentó una DO570 de 0,15 ± 0,03, y para 350 µM presentó una DO₅₇₀ de 0,14 ± 0,02 (Figura 1). A las 24 horas posirradiación de 50 µM de fotosensibilizador esta especie presentó una inhibición del 26% del crecimiento parasitario en comparación a la muestra control; a las concentraciones de 100, 200 y 350 µM se presentó una inhibición del crecimiento parasitario del 65,6%; 72,9% y 73,9%, respectivamente.

Figura 1. Densidad óptica media y desviación estándar de la cuantificación de los cristales de formazán según el ensayo de MTT (Metil Tiazol Tetrazolium), a diferentes concentraciones de ftalocianina en Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis

A las 96 horas posirradiación el porcentaje de inhibición alcanzó el 68,9%; 78,8% y 80,1%, respectivamente. También se determinaron las IC₅₀ de 56,5; 50; 44; y 39,7 µM correspondiente a las 24, 48, 72 y 96 horas, respectivamente (Figura 2). Para la forma intracelular, a las 72 horas posexposición las concentraciones de 50, 75, 100 y 200 µM del fotosensibilizador alcanzaron una inhibición de los amastigotes de Leishmania (V.) peruviana de 20,5%; 46,5%; 65,2% y 57,8%, respectivamente (Tabla 1).

Figura 2. Concentración inhibitoria media (IC50) de la ftalocianina de aluminio clorada en el tratamiento fotodinámico sobre Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis, evaluada a las 24, 48, 72 y 96 horas posirradiación.

Tabla 1. Determinación de la concentración inhibitoria media (IC₅₀) e índice de selectividad de la ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada y estibogluconato de sodio frente a estadios de promastigotes y amastigotes de Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis.

^a Evaluado a 2 × 10⁴ μM de antimoniales pentavalentes
IC₅₀: concentración inhibitoria media; IC95%: intervalo de confianza al 95%
ND: no determinad

Los valores del efecto de la TFD sobre los promastigotes de Leishmania fueron analizados independientemente para cada especie; cada ensayo estuvo conformado por 4 tiempos de evaluación realizados por triplicado a 7 concentraciones diferentes, se analizó un total de 28 tratamientos por especie; los datos obtenidos para Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) braziliensis presentaron una distribución normal para (p = 0,1041 y 0,1036, respectivamente). La comparación de medias por ANOVA permitió determinar que existe diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos en ambas especies de Leishmania (p = 0,0001).

Empleando la prueba de Tukey (α = 0,05), se encontró que la TFD en Leishmania (V.) peruviana con 200 y 350 µM de AlPcClS₄, evaluadas cada una de ellas a 24 y 48 horas, no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05). De manera similar, estas concentraciones evaluadas a las 72 y 96 horas posexposición tampoco presentaron diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) (Figura 3).

Figura 3. Inhibición del crecimiento parasitario de Leishmania, por exposición al tratamiento fotodinámico con ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada (a, b, c, d, e y f, representan a tratamientos que no presentan diferencias estadísticamente significativas, prueba de Tukey p > 0,05).

El tratamiento solo con irradiación a 670 nm y a 5,4 J/cm² sin exposición al agente fotosensibilizador y viceversa, no evidenció efecto fototóxico en comparación con el control de crecimiento.

DISCUSIÓN

El presente estudio evaluó el efecto fototóxico de la ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada en un ensayo in vitro de fo­toterapia sobre promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis y Leishmania (V.) peruviana, mediante el método MTT, que permitió la cuantificación de los cristales de formazán resultante de la actividad enzimática de la enzima deshidrogenasa mitocondrial de los parásitos vivos ⁽¹³⁾. El tratamiento fotodinámico consistió en la irradiación con luz LED a una  longitud de onda de 670 nm y potencia de 5,4 J/cm² sobre los promastigotes de Leishmania en medio de cultivo a las concentraciones de 25; 50; 75; 100; 200 y 350 µM de AlPcClS₄, según la metodología descrita por Amin et al. ⁽⁷⁾ sobre células neoplásicas. En amastigotes, la valoración del efecto de la TFD se desarrolló mediante un PCR cuantitativo.

Las ftalocianinas son compuestos orgánicos químicamente estables que han recibido particular atención en la fototerapia como agente sensibilizador principalmente en el tratamiento de enfermedades infecciosas debido a su baja toxicidad y sus propiedades bioquímicas que mejoran la respuesta humoral y celular frente al agente infeccioso o células blanco en caso de neoplasia. Asimismo, participan en la producción de moléculas oxidativas como las especies reactivas de oxígeno y oxígeno singulete, que actúan directamente sobre los residuos aminoacídicos de proteínas y enzimas como cisteína, metionina, triptófano, entre otros, relacionados a la virulencia del patógeno ⁽¹⁰⁾. Estudios relacionados con la TFD como alternativa al tratamiento de leishmaniasis evaluaron diversos fotosensibilizadores como la ftalocianina de zinc (ZnPc), de aluminio (AlPc) y de aluminio tetrasulfonado (AlPcS4), entre otros, sobre amastigotes y promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (L.) amazonensis, Leishmania (L.) chagasi, Leishmania (L.) major y Leishmania (L.) tropica ^(8,9,18-20), especies causantes de lesiones cutáneas y cutáneo-mucosas ⁽¹⁾, encontrando niveles de IC₅₀ prometedores.

Pinto et al. ⁽⁹⁾ encontraron que el tratamiento fotodinámico in vitro empleando concentraciones de 1 y 10 μM de AlPcClS₄ e irradiado a una longitud de 659 nm sobre promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis evaluados al cuarto día posirradiación logró una inhibición aproximada del 42% y 49%, respectivamente y al noveno día posirradiación, una inhibición del 34% y 41,3%, respectivamente. En Leishmania (L.) major evaluado en las mismas condiciones, el efecto inhibitorio al cuarto día posirradiación fue del 50% en ambas concentraciones, mientras que, al noveno día posirradiación la inhibición fue del 32% y 41% correspondiente a las concentraciones de 1 y 10 μM, respectivamente.

Hernández ⁽²¹⁾ evaluó la ftalocianina de aluminio clorada (AlPcCl) y la ftalocianina de aluminio clorada disulfonada (AlPcClS₂) sobre Leishmania (L.) amazonensis empleando una potencia de irradiación de 3 J/cm² y reportó una IC₅₀ de 0,046 µM ± 0,018 y una IC₅₀ de 4,101 µM ± 0,136, respectivamente. De igual forma Escobar et al. ⁽²⁰⁾ empleando AlPcCl con una irradiación a 10,0 J/cm² a una longitud de a 670 nm reportaron a las 24 horas posirradiación una IC₅₀ de 0,0033 y de 0,17 μM en promastigotes de Leishmania (L.) chagasi y de Leishmania (V.) panamensis, respectivamente. Asimismo, la ftalocianina de Zinc (ZnPc) en las mismas condiciones y con las mismas especies evaluadas presentaron una IC₅₀ de 6,45 μM y 6,05 μM, respectivamente. En nuestro estudio, en el mismo intervalo de tiempo, la IC₅₀ encontrada fue de 56,5 µM y de 67,26 µM para Leishmania (V.) peruviana y para Leishmania (V.) braziliensis, respectivamente.

Es probable que los resultados heterogéneos de la TFD se deban al tiempo y fluencia de irradiación, a la longitud de onda empleada, a la naturaleza del compuesto usado como fotosensibilizador (isómeros), a las propiedades fisicoquímicas relacionadas a la internalización celular y a la carga molecular, estas variables junto al rendimiento cuántico del oxígeno singulete, la localización subcelular, el grado de sulfonación, el tamaño de la molécula, la variedad de los iones de metal, la absorción de la luz, la afinidad por el tejido blanco, la selectividad por compartimentos celulares como la mitocondria y la potencia de irradiación alcanzada en las células, podrían influir en la capacidad del compuesto para atravesar la bicapa lipídica de la membrana celular del parásito y reducir los efectos y la eficiencia del tratamiento fotodinámico ⁽²²⁾.

Similar a lo descrito por Amin et al. ⁽⁷⁾ en el presente estudio la irradiación por sí sola no produjo efecto sobre los promastigotes, macrófagos infectados o macrófagos libres, de igual modo el fotosensibilizador sin exposición a radiación con luz LED no fue tóxico en ninguna de las concentraciones empleadas, lo que es coherente con el principio de la TFD, donde la aplicación independiente del compuesto o irradiación, no generan efecto alguno sobre la viabilidad celular ⁽²³⁾.

En el presente estudio no se logró determinar el índice de selectividad (IS), parámetro útil para estimar la efectividad de un compuesto sobre un determinado patógeno ⁽²⁴⁾, tampoco se logró determinar la concentración letal media (DL₅₀) sobre la línea celular que contiene la forma intracelular de Leishmania, parámetro importante para la determinación del IS, lo que constituye la principal limitación del estudio.

Asimismo, la TFD podría mejorar el rendimiento del tratamiento convencional, lo que implica diversas posibilidades en el manejo de la leishmaniasis tegumentaria como la reducción de la dosis, el tiempo de aplicación de los tratamientos convencionales, el tratamiento específico por especie, entre otros, y como consecuencia la reducción de sus efectos secundarios ^(25,26). Sin embargo, aún se requiere desarrollar estudios que determinen el riesgo de reactivación de la enfermedad o recidiva y la respuesta inadecuada al tratamiento; también es importante desarrollar estudios relacionados a evaluar estrategias que permitan mejorar la eficiencia del tratamiento mediante la exposición a más de un ciclo de irradiación. En el presente estudio se empleó una única irradiación con luz LED por 30 minutos, lo cual probablemente no sea suficiente para afectar a la totalidad de los parásitos. Además, es importante desarrollar estudios de investigación relacionados a formular, desarrollar y evaluar el índice de efectividad y selectividad en líneas celulares y modelos animales para estimar la eficiencia del compuesto sobre el parásito.

En conclusión, la AlPcClS₄ como fotosensibilizador de la TFD presentó un efecto anti-Leishmania constante principalmente sobre promastigotes de Leishmania (V.) peruviana y, en menor proporción en Leishmania (V.) braziliensis, esta última inició un proceso de recuperación a partir de las 72 horas postratamiento, a diferencia de Leishmania (V.) peruviana que denotó una mayor sensibilidad al tratamiento, sin un proceso de recuperación hasta las 96 horas postratamiento. En las formas de amastigotes el efecto fototóxico fue menor, aun así, la respuesta de los macrófagos DH82 infectados con Leishmania (V.) peruviana fue mayor en comparación a los macrófagos infectados con Leishmania (V.) braziliensis.

Agradecimientos: Al Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad - INNOVATE-PERU (Convenio N.o 177-PNICP-PIAP-2015) por el financiamiento del presente trabajo de investigación. Al Centro Nacional de Salud Pública del Instituto Nacional de Salud, por las facilidades prestadas.

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Citar como: Izarra-Rojas KV, Rojas-Palomino N, Gonzales-Medrano JL, Minaya-Gómez G, Berrocal-Huallpa A, Santiago-Contreras J, et al. Efecto inhibitorio in vitro de la ftalocianina de aluminio tetrasulfonada clorada frente a Leishmania (Viannia) peruviana y Leishmania (Viannia) braziliensis. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2020;37(3):462-70. doi: https://doi.org/10.17843/rpmesp.2020.373.4465

Correspondencia: Nyshon Rojas Palomino; Laboratorio de Leishmaniasis, Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú; nyshrojas@gmail.com

Contribuciones de autoría: KVIR, NRP, JLGM y ABH participaron en la concepción, el diseño de la investigación, la recolección de datos, los resultados, el análisis, la interpretación y la redacción del artículo. NRP, GMG, ABH, JSC y JLQ participaron en la concepción, el diseño, la dirección del trabajo, la revisión crítica del artículo, la aprobación de la versión final, el aporte de materiales de estudio. JSC y JLQ participaron en la obtención financiamiento.

Fuente de financiamiento: El estudio ha sido financiado por el Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad - INNOVATE-PERU (Convenio N.o 177-PNICP-PIAP-2015) del Ministerio de la Producción, Lima, Perú.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Recibido: 16/04/2019
Aprobado: 17/06/2020
En línea: 31/07/2020