1, Bióloga, magister en Salud PúblicaGloria Minaya-Gómez
1, bióloga, máster en Medicina Tropical y Salud
Internacional Nyshon Rojas-Palomino
1, biólogoOmar Cáceres
2,3,
biólogo, magister en
Bioquímica y Biología MolecularORIGINAL BREVE
Identificación de especies de Leishmania en pacientes derivados al
Instituto Nacional de Salud del Perú
Identification of Leishmania species in patients derived to the National
Institute of Health, Peru
Aidé Sandoval-Juárez
1, Bióloga, magister en Salud Pública
Gloria Minaya-Gómez
1, bióloga, máster en Medicina Tropical y Salud
Internacional
Nyshon Rojas-Palomino
1, biólogo
Omar Cáceres
2,3,
biólogo, magister en
Bioquímica y Biología Molecular
1 Laboratorio
de Referencia Nacional de Leishmaniasis, Instituto Nacional de Salud, Lima,
Perú.
2 Laboratorio
de Biotecnología y Biología Molecular, Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú.
3 Escuela
de Medicina Humana, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Científica del
Sur, Lima, Perú.
RESUMEN
En el Perú, la leishmaniasis
es una enfermedad metaxénica que representa un serio problema de salud pública,
debido a su amplia distribución y al número de personas en riesgo de contraer
la enfermedad, siendo la población vulnerable principalmente las personas de
bajos recursos económicos. El estudio se realizó a partir de pacientes que
fueron derivados al Instituto Nacional de Salud entre el 2006 y el 2011 para
que se les realizara el diagnóstico especializado. La identificación de la
especie de Leishmania infectante se desarrolló mediante el análisis de
las curvas de disociación (HRMA) obtenidas a partir del ADN genómico de
promastigotes y amastigotes, lo que permitió identificar las especies de Leishmania
(Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) peruviana
como las más prevalentes, además de Leishmania (V.) lainsoni y Leishmania
(L.) amazonensis.
Palabras clave: Leishmaniasis Cutánea; Minicirculos de ADN Cinetoplasto; Tipificación Molecular; Reacción en Cadena en Tiempo Real de la Polimerasa; Perú (fuente DeCS BIREME).
ABSTRACT
In Peru, leishmaniasis is a
metaxenic disease that represents a serious public health problem, due to its
wide distribution and the number of people in danger of contracting the
disease, being the vulnerable population mainly those with low economic
resources. The study was conducted from patients who were derived to Peru’s
National Institute of Health between 2006 and 2011 so that the specialized
diagnosis could be carried out. The identification of the species of infectious
Leishmania was developed through the analysis of the High-Resolution Melting
Analysis obtained from the genomic DNA of promastigotes and amastigotes, which
allows to identify the species of Leishmania (Viannia) braziliensis,
Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) peruviana as more prevalent, in
addition to Leishmania (V.) lainsoni and Leishmania (L.) amazonensis.
Keywords: Cutaneous Leishmaniasis; kDNA minicircles; Molecular Typing; Real-Time PCR; Peru (source: MeSH NLM).
INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis es una
enfermedad metaxénica desatendida. En los últimos cinco años, se ha reportado
en todo el mundo, aproximadamente, un millón de casos de leishmaniasis cutánea,
con un estimado de 220 mil casos por año y más de 399 millones de personas en
riesgo de infección (1,2). En Perú, la leishmaniasis tegumentaria americana (LTA)
es considerada un problema de salud pública por afectar predominantemente a la
población más pobre, debido a su amplia distribución geográfica (3) y la diversidad de especies circulantes. Las
especies más prevalentes son Leishmania (Viannia) braziliensis y Leishmania
(V.) guyanensis, principalmente en las regiones de Madre de Dios, Ucayali
y San Martín; Leishmania (V.) peruviana en Lima, Ancash, La Libertad y
Cajamarca; mientras que Leishmania (L.) amazonensis ha sido poco
reportada, principalmente en las regiones de Junín, Amazonas y Ucayali. Otras
especies como Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) shawi, Leishmania
(V.) panamensis, Leishmania (V.) colombiensis y la especie híbrida Leishmania
braziliensis/peruviana han sido esporádicamente reportadas (4-7).
Entre el 2000 y el 2018, el
Ministerio de Salud (MINSA) del Perú reportó 135 233 casos confirmados, con un
promedio de 7117 casos anuales, de los cuales aproximadamente el 94% (6685
casos) fueron cutáneos y el 6% (432) fueron de la forma cutáneo-mucosa.
Asimismo, en 2018 las regiones de Madre de Dios y Cusco conglomeraron al 25%
del total de los casos reportados (3).
La identificación de las
especies de Leishmania se realiza mediante el secuenciamiento de
múltiples locus (MLST), electroforesis de isoenzimas (MLEE), anticuerpos
monoclonales, secuenciamiento de marcadores moleculares específicos (8,9) y
por amplificación de múltiples marcadores en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) convencional (10). Por otro lado, el análisis de las
curvas de disociación o high resolution melting analysis (HRMA) es un
método molecular posterior al PCR en tiempo real que permite, mediante el
análisis de las curvas de disociación del ADN, la identificación molecular a
nivel de especie (11), de poblaciones, así como mutaciones puntuales
(SNP) (12).
|
MENSAJES CLAVE Motivación para realizar el
estudio: Contribuir en la
descripción, actualización y distribución geográfica de las especies de Leishmania
en el Perú. Principales hallazgos: La identificación de L. (V.) braziliensis, L.
(V.) guyanensis, L. (V.) peruviana, como especies con mayor prevalencia
en el país, además de Leishmania (V.) lainsoni y L. (L.) amazonensis, este
último identificado en una paciente procedente de Huánuco, área sin
antecedente de su circulación. Implicancias: El análisis de las curvas de disociación por
HRMA, permite la identificación rápida
y oportuna de la especie de Leishmania infectante, importante para
determinar el pronóstico de la enfermedad, así como para el desarrollo de
estudios que permitan conocer las distintas especies de Leishmania que
circulan en el Perú. |
El Instituto Nacional de Salud
(INS) es un organismo público ejecutor del MINSA adonde se refieren pacientes
con sospecha clínica de leishmaniasis, derivados principalmente de hospitales
nacionales, Fuerzas Armadas y Sanidad Policial procedentes de diferentes áreas
endémicas del Perú.El INS realiza el diagnóstico confirmatorio de la
enfermedad. En casos cutáneos de reciente evolución, el diagnóstico se logra
principalmente mediante métodos parasitológicos, como el examen microscópico
directo o frotis, ampliamente usado debido a su bajo costo, y el cultivo in
vitro. Mientras que para el diagnóstico inmunoserológico de la forma
cutánea crónica y mucosa de la enfermedad se usa la inmunofluo rescencia
indirecta (IFI) y la prueba intradermoreacción de Montenegro (IDRM). Por otro
lado, a pesar de la eficiencia de los métodos moleculares como el PCR para la
detección del parásito, su implementación está restringido a centros
especializados con equipamiento, infraestructura y presupuesto adecuado, además
de personal especializado que garantice la continuidad del servicio.
El objetivo del presente estudio fue identificar las especies de
Leishmania infectante en pacientes derivados al INS en el periodo
2006-2011, mediante el análisis de las curvas de disociación del ADN.
EL ESTUDIO
El presente estudio fue de
tipo observacional, descriptivo y retrospectivo. La población estuvo conformada
por pacientes con sospecha clínica de LTA acudieron al INS entre el 2006 al
2011, derivados de hospitales nacionales por presentar lesiones cutáneas
ulcerosas de bordes elevados, nodulares o en placas o a nivel de mucosas, y que
fueron confirmados por métodos parasitológicos en el Laboratorio de Referencia
Nacional de Leishmaniasis del INS.
La identificación de Leishmania
se realizó a partir del ADN genómico extraído de amastigotes obtenidos
mediante raspado de la lesión cutánea con lanceta estéril, conservados en
alcohol de 70° y de promastigotes a partir del cultivo in vitro. Las
muestras se obtuvieron como parte del desarrollo de la rutina diagnóstica para
la confirmación del caso. La extracción del ADN se realizó empleando las recomendaciones
del kit comercial PureLink Genomic DNA (Invitrogen, Life-technologies). Las
muestras de ADN fueron eluídas en un volumen de 60 µl y conservadas en congelación
hasta su posterior uso.
El estudio fue realizado
mediante la amplificación de una región del ADN del kinetoplasto (kDNA) en un
termociclador RotorGene Q (Qiagen), en un volumen de reacción de 10 µl; se
empleó 2 μl (5 ng/μl) de ADN parasitario, 0,7 μM de los cebadores A1: 5’-CCG
CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC-3 y A2: 5’-GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA-3’ (13) y
1X de la solución HRM-PCR Master Mix (Kit Tipe-it HRM PCR, Qiagen).
La identificación de las
especies de Leishmania se desarrolló mediante el análisis de las curvas
de disociación empleando cepas referenciales como muestras control, los códigos
OMS se detallan en el Anexo
1. La identificación por HRMA de una muestra problema se
logró por comparación del perfil obtenido frente a un control y expresado en
porcentaje de similitud o semejanza por el programa Rotor Gene Q Series
Software versión 2.3.1.
Asimismo, con la finalidad de
confirmar los hallazgos encontrados en la identificación de Leishmania
por HRMA, se determinó la concordancia con 14 muestras seleccionadas
aleatoriamente por secuenciamiento del gen citocromo B de Leishmania spp,
según metodología descrita por Foulet et al. (8) Los cebadores empleados fueron Lei-CytB09:
5’-TTATGGTGTAGGTTTTAGTYTAGGTT-3’ y Lei-CytB12:
5’-TGCTAAAAAACCACTCATAAATATACT-3’. Las secuencias obtenidas fueron analizados y
comparados con la base de datos del GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank).
Se determinó la frecuencia de
las variables edad, sexo, ocupación, procedencia, tiempo de enfermedad, número
de lesiones, tipo de lesiones, localización y superficie total comprometida de
la lesión. Además, usando las variables del lugar probable de infección (a
nivel regional) y la especie de Leishmania identificada, se elaboró un
mapa de distribución con el sistema de información geográfica Quantum GIS
versión 3.8.
El estudio contó con la
aprobación del Comité de Ética en Investigación del INS. También se solicitó la
autorización de uso y análisis de las cepas al Laboratorio de Referencia
Nacional de Leishmaniasis.
RESULTADOS
Entre enero del 2006 a
diciembre del 2011, 262 pacientes con sospecha clínica de leishmaniasis fueron
derivados al INS, sólo 101 pacientes cumplieron los criterios para el
diagnóstico parasitológico de la enfermedad, 69 (68,3%) de los cuales fueron
confirmados para LTA y 32 (31,7%) fueron negativos en el diagnóstico
parasitológico e inmunoserológico, siendo descartados para la enfermedad.
De los pacientes confirmados,
mediante HRMA y por comparación con las muestras control, se logró la
identificación de Leishmania en 45 pacientes; mientras que, en los 24 restantes
no se logró determinar la especie de Leishmania infectante, debido al
valor de similitud encontrado frente a los controles por debajo del valor de
corte establecido.
De las 45 muestras de los
pacientes confirmados por HRMA, el 40% se identificó como Leishmania (V.)
braziliensis, el 28,9% como Leishmania (V.) guyanensis, el 17,8%
como Leishmania (V.) peruviana, el 6,7% como Leishmania (L.)
amazonensis, y el 6,7% como Leishmania (V.) lainsoni (Figura 1).
Figura
1.
Lesiones causadas por (A) Leishmania (V.)
guyanensis, (B) Leishmania (V.) braziliensis, (C) Leishmania (L.) amazonensis,
(D) Leishmania (V.) lainsoni, y (E) Leishmania (V.) peruviana
Para la identificación de las
especies, se asumió una similitud ≥98% como valor de corte, a excepción de las
muestras identificadas como Leishmania (V.) lainsoni cuyo valor de
corte fue ≥78%. Con este criterio se identificó la especie de Leishmania
infectante en un total de 45 pacientes, 42 de los cuales presentaron una
similitud ≥98% y los tres restantes una similitud ≥78%.
De los 45 pacientes
identificados, 43 (96%) presentaron la forma cutánea, de los cuales 17 (38%)
fueron causados por Leishmania (V.) braziliensis procedentes de
Amazonas, Cajamarca, Cusco, Huánuco, Loreto, Madre de Dios y San Martín; 12
(27%) por Leishmania (V.) guyanensis procedentes de Amazonas, Cusco,
Huánuco, La Libertad, Lima y San Martín 8 (18%) por Leishmania (V.)
peruviana procedentes de Amazonas, Ayacucho, Huánuco, Junín, Lambayeque y
Lima; 3 (7%) por Leishmania (V.) lainsoni procedentes de las provincias
de La Convención, Satipo y Huaura en las regiones de Cusco, Junín y Lima, respectivamente;
y 3 (7,0%) por Leishmania (L.) amazonensis procedentes de las provincias
de La Mar y Huanta en la región de Ayacucho y Churubamba en Huánuco (Anexo
2).
En esta última localidad se
logró identificar la especie descrita a partir de una paciente que tenía la
forma cutánea diseminada. Por otro lado, el 4% estuvo conformado por dos
pacientes procedentes de las provincias de Puerto Inca y Huánuco afectados por
la forma cutáneo-mucosa, en quienes se logró identificar Leishmania (V.)
braziliensis y Leishmania (V.) guyanensis, respectivamente.
Asimismo, los resultados
identificados por HRMA y las 14 muestras secuenciadas aleatoriamente permitieron
determinar una concordancia del 100%.
Las características clínico
epidemiológicas de los 45 pacientes, en quienes se logró la identificación de
la especie de Leishmania infectante se detalla en la Tabla 1.
Tabla
1.
Características sociodemográficas y epidemiológicas de casos confirmados de
leishmaniasis, 2006-2011 (n=45)
a Comerciante,
albañil, ingeniero, profesor, empleado público, obrero; b incluye un
caso de Leishmaniasis cutánea diseminada; c pierna, pantorrilla,
pie, rodilla, tobillo, muslo, mano, dedo, brazo, antebrazo, codo; d
pecho, espalda, cadera; e fosas nasales, labios, orejas, mejillas,
frente, mentón, cabeza, cuello
DISCUSIÓN
En la presente investigación,
se desarrolló la identificación de Leishmania en 45 pacientes
confirmados para LTA, mediante el análisis de las curvas de disociación del
kDNA, lográndose la identificación de Leishmania (V.) braziliensis,
Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) peruviana, Leishmania (V.) lainsoni
y Leishmania (L.) amazonensis, especies reportadas en estudios
previos (4,14).
Para la identificación de las
especies de Leishmania se estableció un valor de corte relacionado con
el grado de divergencia genética, la estrecha relación entre Leishmania (L.)
amazonensis y Leishmania (L.) mexicana en el subgénero Leishmania
y Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) peruviana, Leishmania
(V.) guyanensis y Leishmania (V.) panamensis en el subgénero Viannia,
ha motivado la elección del ≥98% de similitud como valor de corte, a diferencia
del ≥78% de similitud asumido para Leishmania (V.) lainsoni, debido a
que esta especie presenta características particulares a nivel de kDNA, que
difiere de las demás especies del subgénero Viannia (15,16).
En nuestro estudio, esta especie fue identificada en muestras de tres pacientes
procedentes de Cusco, Junín y Lima, en esta última se logró la confirmación por
secuenciamiento del gen citocromo B, mientras que las muestras procedentes de
Cusco y Junín fueron confirmadas mediante análisis de fragmentos de restricción
de longitud polimórfica (PCR-RFLP) (17). Por el contrario, las
muestras de pacientes que no alcanzaron el valor de corte no fueron consideradas
debido a que la identificación podría no ser correcta.
Asimismo, de las 45 muestras
identificadas, el 61% fue aislado de pacientes de procedencia selvática y el
39% de procedencia andina, principalmente de la vertiente occidental de los
andes y valles interandinos, lo cual permitió determinar a Leishmania (V.)
braziliensis seguido por Leishmania (V.) guyanensis y Leishmania
(V.) peruviana como las especies más prevalentes, ampliamente reportadas en
nuestro país (7,18). No obstante, la posición ordinal de las mismas
puede variar dependiendo de la procedencia de la población, tal como se
evidencia en el estudio realizado por Lucas et al. en el cual, a partir
de una población selvática se determinó a Leishmania (V.) braziliensis,
seguido por Leishmania (V.) peruviana y Leishmania (V.) guyanensis como
las más prevalentes.
Del mismo modo, estudios de
Arévalo et al. y Kato et al. en poblaciones predominantemente
andinas, donde circula principalmente Leishmania (V.) peruviana, determinaron
a esta especie como la más prevalente seguido por Leishmania (V.) braziliensis
y Leishmania (V.) guyanensis. Otras especies reportadas en la
vertiente occidental de los Andes y valles interandinos fueron Leishmania
(V.) braziliensis en Ancash y Lima (18), y Leishmania (V.)
guyanensis en Lambayeque, Lima (19) y La Libertad (14).
Con respecto a la forma
cutáneo-mucosa, a partir de parásitos obtenidos de dos pacientes procedentes de
Huánuco, se logró identificar a Leishmania (V.) braziliensis y
Leishmania (V.) guyanensis como las especies infectantes, ambas con
reconocida capacidad para desarrollar metástasis y evolucionar a formas
agresivas de la enfermedad (20,21). Para la forma clínica
cutáneo-mucosa se ha reportado una ocurrencia entre el 5% al 20% del total de
casos de leishmaniasis, dependiendo de la región geográfica (21). En
Perú, se reporta aproximadamente el 6% de la forma cutáneo-mucosa del total de
casos anuales (3). Asimismo, se logró identificar a Leishmania (L.)
amazonensis como agente causal de leishmaniasis cutánea diseminada en una
paciente proveniente de Huánuco, los casos de leishmaniasis con esta forma
clínica diseminada, son inusuales y generalmente son comunicados como reportes
de casos.
La concordancia de 100%
obtenida entre el secuenciamiento por método Sanger y el HRMA, nos permite
afianzar la capacidad de este último, y del kDNA empleado como marcador en la
identificación de las especies de Leishmania infectante y, a diferencia
del secuenciamiento, con menor consumo de tiempo y recursos económicos.
Las limitaciones del presente
estudio están referidas al periodo en que se tomaron las muestras (2006-2011),
a la desigual distribución geográfica de los pacientes, predominantemente de la
región selva, a la falta de identificación del total de las muestras
confirmadas debido a la baja carga parasitaria lo que no permitió alcanzar el
valor de corte establecido para la identificación por HRMA, a los altos costos
de la identificación por secuenciamiento mediante el método Sanger, por lo que
no fue posible confirmar las 31 muestras restantes identificadas.
En conclusión, del análisis de
las curvas de disociación del ADN o HRMA de 45 pacientes, se lograron
identificar las especies de Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.)
peruviana, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) lainsoni y Leishmania
(L.) amazonensis, circulantes en 13 regiones de Perú con transmisión
autóctona de leishmaniasis. Asimismo, reportamos por primera vez la
circulación de Leishmania (V.) amazonensis en la región Huánuco,
identificada a partir de un caso con leishmaniasis cutánea diseminada. La
continuación de estudios relacionados a la identificación de especies de Leishmania
con un número mayor de muestras, permitirá contar con un mejor conocimiento
acerca de la distribución y dispersión de las especies de Leishmania spp,
considerando el desplazamiento del vector, las variaciones climatológicas,
migraciones, actividades extractivas, entre otros factores.
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Financiamiento: Este trabajo fue financiado por el Centro Nacional Salud
Pública del Instituto Nacional de Salud de Perú.
Material suplementario: Disponible en la versión electrónica de la RPMESP
Citar como: Sandoval-Juárez A, Minaya-Gómez G, Rojas-Palomino
N, Cáceres O. Identificación de especies de Leishmania en pacientes
derivados al Instituto Nacional de Salud del Perú. Rev Peru Med Exp Salud
Publica. 2019;37(1):87-92. Doi: https://doi.org/10.17843/rpmesp.2020.371.4514.
Correspondencia: Aide Sandoval Juarez; Jr. Capac Yupanqui 1400, Jesus María, Lima, Perú; aidesandoval5@gmail.com.
Contribuciones de los autores: ASJ conceptuó la investigación, realizó la colecta
de datos, proceso y analizó los datos, redactó el manuscrito. GMG realizó el
análisis de datos, redacción del manuscrito y revisión crítica. NRP desarrolló
el análisis molecular, redactó el manuscrito y realizó la revisión crítica. OC
redactó el manuscrito y revisión crítica. Todos los autores aprobaron la
versión final del manuscrito.
Conflictos de interés: Ninguno
Recibido:
03/05/2019
Aprobado:
15/12/2019
En línea:
23/03/2020