Resistencia a nitrofuranos en Salmonella enterica aisladas de carne para consumo humano

Resistencia a nitrofuranos en Salmonella enterica aisladas de carne para consumo humano

Nitrofuran resistance in Salmonella enterica from human consumption meat samples

Sandra Martínez-Puchol

¹, Magíster en Biología
María J. Pons

², PhD en Biología
Lidia Ruiz-Roldán

¹, PhD en Biología
Laura Laureano-Adame

³, PhD en Biología
Alfredo Corujo

³, PhD en Biología
Theresa J. Ochoa

^4,5, medico infectólogo, magíster en Medicina
Joaquim Ruiz

^1,6, PhD en Biología

¹Instituto de Salud Global, Hospital Clinic - Universitat de Barcelona, Barcelona, España.
²Laboratorio de Microbiología Molecular y Genómica Bacteriana, Universidad Científica del Sur, Lima, Perú.
³ Nutreco, Toledo, España.
⁴Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú.
⁵Department of Epidemiology, School of Public Health, University of Texas Health Science Center at Houston, Estados Unidos.
⁶Universidad Continental, Lima, Perú.

En el presente estudio, se analizaron los mecanismos de resistencia a nitrofuranos en 18 muestras cárnicas con Salmonella enterica (15 de pollo, 2 de ternera y 1 de cerdo) de mercados de Lima (Perú). Determinaron los serotipos de los aislamientos y la sensibilidad a furazolidona y nitrofurantoina (con y sin el inhibidor de bombas de expulsión Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide [PAβN]), las mutaciones en los genes snrA y cnr por PCR y la transferabilidad de la resistencia por conjugación. Se identificaron 15 muestras con S. infantis (13 muestras de pollo), 2 con S. enteritidis y 1 con S. anatum. Todos los aislamientos, excepto S. anatum, fueron resistentes a ambos nitrofuranos (concentración mínima inhibidora [CMI] a furazolidona: 32-64 µg/mL, CMI a nitrofurantoina: 128-256 µg/mL), sin diferencias al adicionarse PAβN. Todos los aislamientos resistentes a nitrofuranos presentaron sustituciones en snrA y cnr (S. infantis: snrA STOP-151; cnr STOP-137; S. enteritidis: snrA STOP-180; cnr STOP-179). No se detectaron mecanismos transferibles de resistencia a nitrofuranos.

Palabras clave: Resistencia a Antibióticos; Furazolidona; Salmonella (fuente: DeCS BIREME).

The mechanisms of resistance to nitrofurans from 18 meat samples with Salmonella enterica (chicken: 15; beef: 2; pork: 1) collected in Lima (Peru) were analyzed. The isolates were serotyped and the susceptibility levels to furazolidone and nitrofurantoin [with and without the efflux pump inhibitor Phenyl-Arginine- β-naphthylamide (PAβN)], the presence of mutations in the snrA and cnr genes and the transferability of resistance by conjugation were established. Fifteen samples with S. infantis (13 from chicken samples), 2 with S. enteritidis and 1 with S. anatum were identified. All isolates except the S. anatum were resistant to both nitrofurans showing MICs (minimum inhibitory concentration) of furazolidone and nitrofurantoin of 32-64 μg/mL and 128-256 μg/mL, respectively. The addition of PAßN had no effect on the MIC levels. All nitrofuran-resistant isolates showed amino acid codon alterations at both snrA and cnr (S. infantis: snrA STOP-151; cnr STOP-137; S. enteritidis: snrA STOP-180; cnr STOP-179). No transferable mechanisms of nitrofuran resistance were detected.

Los nitrofuranos son un grupo de antimicrobianos de origen sintético activos frente a parásitos y bacterias Gram-negativas y Gram-positivas ⁽¹⁾. Estos compuestos han sido ampliamente utilizados tanto en medicina humana como veterinaria, así como en promotores de crecimiento de animales destinados al consumo humano ⁽¹⁾. Actualmente, su uso en veterinaria para animales de consumo humano está prohibido en numerosos países debido al riesgo a que estos antimicrobianos o sus metabolitos permanezcan en el alimento ⁽¹⁾. Su uso veterinario está prohibido en Perú desde 2013 ⁽²⁾.

En líneas generales, los niveles de resistencia a nitrofurano en Enterobacteriaceae causantes de diarrea, como por ejemplo Shigella spp., son bajos ⁽³⁾, habiéndose reportado los mayores niveles de resistencia a estos antimicrobianos en Salmonella spp. ^(4,5). En la actualidad, los mecanismos de acción de los nitrofuranos están poco estudiados, habiéndose descrito principalmente en mutantes obtenidos in vitro.

Se ha descrito que los nitrofuranos precisan ser activados por nitroreductasas para ejercer su acción; la reacción de reducción constaría de varios pasos secuenciales, considerando que algunos de los productos generados en estos pasos intermedios podrían poseer actividad antimicrobiana ^(6,7). Las nitroreductasas implicadas en estos procesos de activación son NfsA y NfsB ⁽⁶⁾. Así, en Escherichia coli, la presencia de alteraciones capaces de reducir o eliminar la funcionalidad de estas enzimas se ha asociado con el desarrollo de resistencia a nitrofuranos, tanto en estudios con mutantes obtenidos in vitro como en estudios desarrollados con aislamientos clínicos ^(8-10). También se ha descrito el rol de bombas de expulsión en la resistencia a nitrofuranos. Además, se ha constatado que la bomba de expulsión OqxAB, perteneciente a la familia RND (del inglés Resistance-Nodulation-Division), es capaz de conferir resistencia a nitrofurantoina ⁽¹¹⁾.

Pese a los antecitados mayores niveles de resistencia presentes en Salmonella spp., el número de estudios realizados enfocados al estudio de los mecanismos de resistencia a nitrofuranos es escaso ^(5,12). Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar los niveles y mecanismos de resistencia a nitrofuranos en aislamientos de Salmonella enterica procedentes de muestras cárnicas adquiridas en mercados tradicionales de Lima.

MENSAJES CLAVE

Motivación para realizar el estudio: Los crecientes niveles de resistencia a antimicrobianos en Perú constituyen una sería preocupación. No obstante, hay una escasez de datos respecto a la resistencia a nitrofuranos en Salmonella spp.

Principales hallazgos: Existen altos niveles de resistencia a nitrofuranos en Salmonella spp. correlacionados con la presencia de mutaciones cromosomales en los genes cnr y snrA.

Implicancias: Los resultados del estudio muestran la necesidad de investigaciones sistemáticas de los niveles de resistencia a nitrofuranos en Salmonella spp. dirigidas no solo a niveles y mecanismos, sino también a las causas de la selección natural de aislamientos resistentes.

Se utilizaron 18 muestras con Salmonella enterica aisladas en 2012 de un estudio previo, que tuvo como objetivo determinar la presencia de Enterobacteriaceae y los niveles de resistencia a antimicrobianos de E. coli en muestras cárnicas (cerdo, pollo o ternera), adquiridas en mercados tradicionales del norte (Comas, San Martín), centro (La Victoria, Cercado de Lima) y sur (Villa El Salvador) de Lima ⁽¹³⁾. El estudio se realizó en el ISGlobal, Hospital Clinic - Universitat de Barcelona (España), Nutreco (España) y el Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (Perú). En todos los casos los aislamientos fueron identificados previamente por métodos bioquímicos y confirmados mediante amplificación del gen invA ⁽¹³⁾. Los aislamientos de S. enterica se recuperaron de -80 ºC y de manera previa a su uso se reconfirmaron mediante la amplificación y secuenciación del gen 16S rRNA ⁽¹⁴⁾.

Se determinó los serotipos de los aislamientos mediante microarrays (Check & Trace Salmonella kit, Check-Points B.V, Wageningen, Holanda) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras ello se procedió a determinar la sensibilidad a furazolidona (100 µg) y nitrofurantoina (300 µg) mediante el método de difusión en disco (BD, San Agustín del Guadalix, España), así como los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante el método de dilución en agar, siguiendo las directrices de la guía CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) y utilizando la cepa E. coli ATCC 25922 como control de calidad ⁽¹⁵⁾. En la guía CLSI no existe un punto de corte específico para furazolidona, por lo que en este caso se reportan los datos de CMI y/o diámetro de halo.

Tanto para nitrofurantoina como para furazolidona, los valores de CMI se determinaron en presencia de Phenyl-Arginine-ß-Naphthylamide (PAßN, por sus siglas en inglés), un inhibidor de bombas de expulsión de tipo RND ⁽⁸⁾. Para su uso, el PAßN se disolvió en dimetil sulfoxido (DMSO), motivo por lo que determinó el efecto de este solvente en el crecimiento bacteriano.

En todos los aislamientos, se amplificaron los genes nfsA y nfsB mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) (ciclo inicial de 94 ºC por cinco minutos, seguido por 35 ciclos de 94 ºC por 40 segundos cada uno, 60 ºC por 30 segundos, 68 ºC por 40 segundos, y una extensión final de 72 ºC por cinco minutos). La PCR se realizó con los cebadores descritos por Salamanca-Pinzón et al. ⁽¹⁶⁾, visualizándose en geles de agarosa al 2% teñidos con SYBR Safe (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.). Las bandas obtenidas fueron recuperadas del gel y se purificaron utilizando el kit Wizard SV Gel and PCR Clean Up System (Promega, Madison, EE. UU.). Los productos purificados fueron enviados a Macrogen (Seul, Corea del Sur) para su secuenciación.

Por último, la presencia de mecanismos transferibles de resistencia a nitrofuranos se determinó por conjugación siguiendo el protocolo previamente descrito ⁽¹⁷⁾. Para este fin se utilizó como cepa receptora a E. coli J53 (resistente a azida sódica) y agar Mueller-Hinton suplementado con azida sódica (150 µg/ml) y furazolidona (16 µg/ml) como medio para seleccionar los transconjugantes.

Los 18 aislamientos que se incluyeron en el presente estudio provenían de cuatro mercados diferentes de las tres áreas del estudio original (cono norte, centro y sur) (Tabla 1), lo que demostró, por tanto, una amplía diseminación por toda el área de Lima.

N: Número de aislamientos de S. enterica. Solo se consideró un aislamiento de Salmonella por muestra

Los resultados del serotipado mostraron que la mayoría de los aislamientos pertenecían al serotipo infantis (15 aislamientos, 83,3%). Las tres cepas restantes se clasificaron como enteritidis (dos cepas, 11,1%) y anatum (una cepa, 5,6%). Los aislamientos del serotipo infantis se recuperaron de los tres tipos de muestras cárnicas, en especial de las muestras de pollo. Así 13 de los 15 aislamientos recuperados procedían de muestras de pollo, mientras que se aisló una de S. infantis en muestras de ternera, y otra en muestras de cerdo. Por su parte, los dos aislamientos de S. enteritidis provinieron de muestras de pollo y el de S. anatum de ternera (Tabla 1).

Todos los aislamientos, a excepción de la cepa de S. anatum, presentaron niveles de CMI de 32-64 µg/ml para furazolidona, siendo resistentes a nitrofurantoina con CMIs de 128-256 µg/ml. El aislamiento de S. anatum presentó CMIs de 8 µg/ml para furazolidona y de 32 µg/ml para nitrofurantoina (Tabla 2).

Tabla 2. Niveles y mecanismos de resistencia a nitrofuranos en Salmonella spp.

n: número de aislamientos; CMI: concentración mínima inhibitoria; wt: ausencia de mutaciones.

Asimismo, se observó correlación entre los valores de CMI y los halos observados en los estudios con discos de antibiótico. Así, en el caso de los aislamientos resistentes a nitrofurantoina se observaron halos de 8- 11 mm de diámetro para este antibiótico y de 8-13 mm para furazolidona, mientras que el aislamiento sensible presentó halos de 20 mm a nitrofurantoina y 24 mm a furazolidona.

La adición de PAßN no afectó los valores de CMI, que en todos los casos permanecieron inalterados, lo cual mostró la no implicación de bombas de expulsión tipo RND en el desarrollo de resistencia a nitrofuranos en los aislamientos estudiados. Ni PAßN ni DMSO interfirieron con el crecimiento normal de las bacterias.

Todos los aislamientos resistentes a nitrofuranos presentaron mutaciones en snrA y cnr. Los 15 aislamientos de S. infantis presentaron sendos codones STOP en la posición 151 de snrA y 137 de cnr, mientras que las dos S. enteritidis los presentaron en las posiciones 180 de snrA y 179 de cnr (Tabla 2). Por último, no se obtuvieron transconjugantes resistentes a nitrofuranos en los estudios de conjugación.

A pesar de que el uso de nitrofuranos en animales de consumo está prohibido en numerosos países, la resistencia a estos mismos se ha descrito en enteropatógenos, como es el caso de Salmonella spp., aisladas de muestras alimentarias ^(4,5); incluso, en algunos casos se han detectado restos de nitrofuranos en productos cárnicos ⁽¹⁸⁾. Hay varias explicaciones posibles a estos hechos, las cuales incluyen la estabilidad de la resistencia a nitrofuranos, el uso de estos antimicrobianos, pese a tratarse de productos prohibidos, o la existencia de contaminación ambiental ^(4,8,18).

El hecho que los enteropatógenos aislados tuviesen como origen muestras de los tres tipos de carnes (pollo, ternera y cerdo), incluidos en el estudio y su presencia en las diferentes zonas de Lima, sugiere la amplia diseminación geográfica en el país de S. enterica resistentes a nitrofuranos. No obstante, se ha de considerar que las muestras procesadas se colectaron en 2012, un año antes de la prohibición en Perú del uso de nitrofuranos en la cría de animales de consumo ⁽²⁾.

Se ha observado que la adquisición de resistencia a nitrofuranos es un hecho secuencial, en el que las nitrorreductasas NfsA y NfsB acumulan alteraciones que afectan su funcionalidad y que poseen un efecto aditivo en los niveles finales de resistencia a nitrofuranos ⁽⁹⁾. Los resultados del presente estudio fueron concordantes, detectándose la presencia de mutaciones conducentes a la presencia de codones STOP en los genes equivalentes (snrA y cnr) y a la subsiguiente falta de nitroreductasas funcionales. Hasta la fecha muy pocos estudios han analizado los mecanismos de resistencia a nitrofuranos en S. enterica; en ellos se han encontrado escenarios similares, con presencia de codones STOP u otras alteraciones en los genes snrA o cnr ^(5,12).

Si bien en el presente estudio no se obtuvieron transconjugantes resistentes a nitrofuranos, se han descrito mecanismos transferibles de resistencia a nitrofuranos. Entre estos, merece una especial atención la bomba de expulsión OqxAB, la cual ha sido recientemente implicada en el desarrollo de resistencia a nitrofurantoina ⁽¹¹⁾. OqxAB es una bomba de expulsión de tipo RND, indígena de Klebsiella spp., la cual fue detectada y codificada por primera vez en plásmido en aislamientos de E. coli de origen veterinario en un estudio sobre la resistencia a olaquindox ⁽¹⁹⁾. En Perú, el uso de olaquindox en animales de consumo se prohibió a la par que el de nitrofuranos ⁽²⁾. En la actualidad, se conocen al menos 14 alelos de oqxA y 28 de oqxB codificados en plásmidos, sin que la actividad específica de cada uno de ellos haya sido establecida ⁽¹⁹⁾.

La presencia de mutaciones en acrB, emrD, yajR o macB, genes codificantes de bombas de expulsión cromosomales, ha sido implicada en el desarrollo de resistencia a nitrofuranos ⁽²⁰⁾. La más estudiada de estas bombas es AcrAB que, al igual que OqxAB, es una bomba de expulsión de tipo RND. La bomba AcrAB, al igual que otras bombas de tipo RND incluyendo a OqxAB, puede ser inhibida usando substancias como PAßN ^(19,20). En el presente estudio no se observó efecto de PAßN, por lo que se descartó que la sobreexpresión de bombas tipo AcrAB estuviese implicada en el desarrollo de resistencia a nitrofuranos en estos aislamientos, aportando además una evidencia complementaria sobre la ausencia de bombas plasmídicas OqxAB. En un estudio previo en el que se desarrollaron mutantes de E. coli resistentes a furazolidona, tampoco se detectó implicancia de bombas de expulsión inhibibles por PAßN ⁽⁸⁾.

Debido a la metodología utilizada la presencia de mecanismos de resistencia transferibles que solo confiriesen modestos incrementos en los niveles de resistencia, podría haber pasado desapercibida, lo que constituye una limitación del presente estudio. Asimismo, los aislamientos incluidos en el estudio son del 2012, lo que resalta la necesidad de efectuar nuevos estudios que permitan valorar la situación actual.

El presente estudio describe la presencia de niveles altos de resistencia a nitrofuranos en aislamientos de Salmonella enterica procedentes de muestras de alimentos cárnicos comercializados en el área de Lima. Estos niveles de resistencia se relacionaron de manera directa con la presencia de mutaciones cromosomales en los genes snrA y cnr. Es preciso mantener un seguimiento de los niveles de resistencia a nitrofuranos en S. enterica.

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Fuentes de financiamiento: Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2012 (búsqueda de antibióticos y microorganismos resistentes en animales de consumo humano y piensos animales); JR fue apoyado por el programa I3 del Ministerio de Economía y Competitividad, España (número de concesión: CES11/012). “ISGlobal is a member of the CERCA Programme, Generalitat de Catalunya”.

Citar como: Martínez-Puchol S, Pons MJ, Ruiz-Roldán L, Laureano-Adame L, Corujo A, Ochoa TJ, et al. Resistencia a nitrofuranos mediada por mutaciones en los genes cnr y snrA en Salmonella enterica procedentes de muestras cárnicas para consumo humano. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2020;37(1):99-103. Doi: https://doi.org/10.17843/rpmesp.2020.371.4745.

Correspondencia: Joaquim Ruiz; Apartado 16, 08214-Badia del Valles, Barcelona, España; joruiz.trabajo@gmail.com

Contribuciones de autoría: SMP, MJP y JR participaron en la concepción y diseño del artículo. SMP, MJP, LRR, LLA y AC participaron en la recolección de resultados. SMP, MJP y JR participaron en el análisis e interpretación de datos. MJP, JR y TJO participaron en la redacción del artículo. Todos los autores realizaron la revisión crítica del artículo, aprobaron la versión final y asumen responsabilidad de los contenidos del manuscrito.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflicto de interés.