RESUMEN

Objetivos: Estandarizar una prueba RT-LAMP in house para la detección de SARS-CoV-2 y validarla con muestras de laboratorio y de campo en pacientes con sospecha clínica de COVID-19.

Materiales y métodos: Se estandarizó una prueba molecular RT-LAMP in house para la detección de SARS-CoV-2 estableciéndose el límite de detección con células Vero de cepas peruanas aisladas de SARS-CoV-2. Se validó la prueba en laboratorio con 384 muestras de hisopado nasal y faríngeo (HNF) obtenidas entre marzo y julio de 2020. Para la validación de campo se obtuvieron muestras de HNF de 383 casos sintomáticos sospechosos de COVID-19. Todas las muestras fueron evaluadas por RT-LAMP y RT-qPCR. Para la validación de laboratorio y de campo se consideró como estándar de referencia al RT-qPCR, se calcularon medidas de concordancia y rendimiento diagnóstico.

Resultados: El límite de detección fue consistente en los casos con umbral de ciclo (Ct) Ct < 30 en ambas pruebas, mostrando eficiencia para detectar hasta 1000 copias/µL del gen diana. Se evidenció robustez con la mitad de las concentraciones de cebadores y 20 µL de volumen final. Se identificó ausencia de amplificación para otros coronavirus humanos. La concordancia en laboratorio obtuvo un Kappa de 0,88 (IC 95%: 0,83–0,93) y en campo fue de 0,89 (IC 95%: 0,84−0,94); la sensibilidad en laboratorio fue de 87,4% (IC 95%: 80,8−92,4) y en campo fue de 88,1% (IC 95%: 81,6−92,9), la especificidad en ambos escenarios fue de 98,8% (IC 95%: 96,4−99,7).

Conclusiones: La prueba RT-LAMP in house fue validada por presentar una adecuada robustez, sin reacciones cruzadas, buena concordancia y rendimiento diagnóstico comparado con el RT-qPCR.

Palabras Clave: COVID-19; Diagnóstico; Técnicas de Diagnóstico Molecular; Reacción en Cadena de la Polimerasa; Estudio de Validación; Sensibilidad y Especificidad; Curva ROC; Valor Predictivo de las Pruebas; Reacciones Cruzadas (fuente: DeCS BIREME).

ABSTRACT

Objectives: To standardize and validate an in-house RT-LAMP test for the detection of SARS-CoV-2, based on laboratory and field assays using samples from COVID-19 suspected patients.

Materials and methods: An in-house SARS-CoV-2 RT-LAMP molecular test was standardized, establishing the detection limit with Vero cells of isolated Peruvian strains of SARS-CoV-2, and the robustness to various concentrations of primers. The laboratory validation was performed with 384 nasal and pharyngeal swab samples (UFH) obtained between March and July 2020. The field validation was performed with 383 UFH obtained from COVID-19 suspected symptomatic cases. All samples were tested by RT-LAMP and RT-qPCR. The RT-qPCR was considered as the reference standard test. The concordance measures and diagnostic performance were calculated.

Results: The detection limit was consistent in cases with Ct <30 in both tests, showing efficiency to detect up to 1000 copies/μL of the target gene. Robustness was evidenced with half of the primer concentrations and 20 μL of final volume. Absence of amplification was identified for other HCoVs. Concordance showed a kappa index of 0.88 (95% CI: 0.83-0.93) and 0.89 (95% CI: 0.84 - 0.94) in laboratory and field settings, respectively. The sensitivity value in the laboratory was 87.4% (95% CI: 80.8 - 92.4) and 88.1% in the field (95% CI: 81.6 - 92.9). The specificity value in both settings was 98.8% (95% CI: 96.4-99.7).

Conclusions: The in-house SARS-CoV-2 RT-LAMP test was successfully validated based on its adequate robustness, no cross-reactions, good concordance, and diagnostic performance compared to RT-qPCR.

Keywords: COVID-19; Diagnosis; Molecular Diagnostic Techniques; Polymerase Chain Reaction; Validation Study; Sensitivity and Specificity; ROC Curve; Predictive Value of Tests; Cross Reactions (source: MeSH NLM).

INTRODUCCIÓN

La COVID-19 es un grave problema de salud pública, alcanzando más de 98 millones de casos confirmados y más de dos millones de muertes en el mundo, al 24 de enero de 2021⁽¹⁾. La gran expansión de la enfermedad representa un desafío importante para los países en desarrollo, los cuales deben lidiar con sus brechas sanitarias para el diagnóstico de casos. Estas limitaciones se evidencian en las zonas rurales, donde es necesario desarrollar tecnologías sanitarias descentralizadas para el diagnóstico temprano de casos ⁽²⁾.

La realización de pruebas moleculares requiere considerable inversión financiera y logística, en comparación con otras herramientas de diagnóstico. La prueba de referencia sugerida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la detección del SARS-CoV-2 es la prueba de reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR), la cual requiere de un laboratorio molecular, con infraestructura, equipos y reactivos costosos, así como personal especializado; recursos que no siempre están disponibles en países como el Perú ^(3,4).

En Perú, al inicio de la pandemia, la prueba de RT-qPCR solo se pudo realizar de forma estandarizada en Lima en el Laboratorio Nacional de Referencia de Virus Respiratorios del Instituto Nacional de Salud (INS). Progresivamente, su procesamiento se extendió a laboratorios regionales de manera descentralizada. Actualmente, existen más de 50 laboratorios a nivel nacional; pero la demanda de estas pruebas, en la práctica, no se ha cubierto plenamente ⁽⁵⁾.

La imperante necesidad de contar con otras alternativas diagnósticas en fase aguda para la infección por SARS-CoV-2 se ha evidenciado a través del desarrollo de pruebas basadas en el sistema CRISPR/Cas ⁽⁶⁾, o en el método de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) ⁽⁷⁾. Otras pruebas basadas en el método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) se han aplicado en el Perú para enfermedades como zika ⁽⁸⁾, tuberculosis ⁽⁹⁾, malaria ⁽¹⁰⁾, y dengue ⁽¹¹⁾; evidenciando un adecuado rendimiento. Es más factible y viable su implementación ya que se utilizan equipos más económicos, empleándose de cuatro a seis cebadores, dos / tres hacia adelante y dos / tres hacia atrás para identificar dianas de ADN, permitiendo sus amplificaciones ⁽¹²⁾.

La prueba de RT-LAMP se presenta como una alternativa rápida y eficiente para la identificación de casos sospechosos, pues el tiempo de procesamiento de muestras en laboratorio es de aproximadamente 50 minutos, respecto a las cuatro a ocho horas que se requiere para la prueba de RT-qPCR ⁽⁷⁾.

El presente estudio tiene por objetivo estandarizar en laboratorio una prueba de RT-LAMP desarrollada in house para la detección de SARS-CoV-2, y validarla en campo en pacientes con sospecha clínica de COVID-19, obteniendo medidas de rendimiento diagnóstico, tomando como referencia los resultados de la prueba de RT-qPCR.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo de estudio

Se llevó a cabo un estudio transversal que estuvo orientada a evaluar una prueba de RT-LAMP para la detección del SARS-CoV-2 en tres etapas: a) estandarización, b) validación en laboratorio, y c) validación en campo. El estándar de referencia considerado en el estudio fue la RT-qPCR. El diseño de la estandarización fue transversal descriptivo, y el diseño de la validación de laboratorio y de campo fue transversal analítico.

Estandarización

Esta etapa se llevó a cabo en el Laboratorio Nacional de Referencia de Virus Respiratorio del INS entre junio y julio del 2020. Para evaluar el desempeño de la prueba de RT-LAMP según estándares de la OMS, se usó la cepa de SARS-CoV-2 aislada en células VERO81 a partir de una muestra de hisopado nasofaríngeo (HNF) con diagnóstico molecular por RT-qPCR positivo y muestras de HNF que fueron obtenidas previamente durante vigilancia epidemiológica rutinaria de descarte de la COVID-19. Usando la cepa se evaluó: a) el límite de detección (bajo dilución seriada en base 10), b) la robustez ante cambios en la concentración de cebadores (original y mitad – 0,5P) y reducción porcentual del volumen final de reacción (20% – 0,8V; 40% – 0,6V; 50% – 0.5V y 60% – 0.4V), y c) la repetibilidad.

Validación en laboratorio

El análisis de reacción cruzada fue realizado in silico alineando las secuencias de cebadores externos de la RT-LAMP con secuencias de referencia de los coronavirus humanos conocidos (HCoV) (NC_005831.2, HCoV-NL63; NC_002645.1, HCoV-229E; NC_006213.1, HCoV-OC43 cepa ATCC VR-759; NC_006577.2, HCoV-HKU1; NC_004718.3, SARS-CoV-1; NC_019843.3, MERS-CoV coronavirus relacionado con el síndrome respiratorio de Oriente Medio; FJ415324.1, HECoV 4408; NC_045512.2, SARS-CoV-2 de origen chino) ⁽¹³⁾. Además, los cebadores externos fueron alineados con 194 cepas peruanas disponibles en el GISAID (https://www.gisaid.org/). Todos los experimentos in vitro fueron realizados en triplicado por el mismo operador en las mismas condiciones ambientales y de equipos ⁽¹³⁾.

Para establecer la validez diagnóstica de la prueba en laboratorio, se calculó un tamaño de muestra mediante la fórmula de estimación del rendimiento diagnóstico por medio del programa Epidat versión 4.2, considerando un valor de 91,489% de sensibilidad y 99,531% de especificidad, cifras calculadas según lo reportado por Jiang et al., en el total de su muestra ⁽¹⁴⁾; se consideró un nivel de significancia del 95%, error absoluto del 5% y probabilidad de positividad del 39,5% (basado en la proporción de resultados positivos obtenidos habitualmente en actividades diagnósticas de los equipos de respuesta rápida de campo por el INS entre el 6 al 8 de julio del 2020 en la jurisdicción de la Dirección de Redes Integradas de Salud (DIRIS) Centro).

Se asumió una tasa de pérdida del 20% a fin de prever problemas logísticos que pudieran presentarse durante la manipulación y/o análisis de las muestras. Con estos parámetros se estableció la necesidad de contar con, al menos, 379 muestras. Para esta etapa fueron empleadas muestras de HNF, las cuales fueron obtenidas previamente durante evaluaciones epidemiológicas rutinarias de descarte de la COVID-19 entre el inicio de la pandemia y julio de 2020; cuyos viales estaban almacenados en los laboratorios del INS. Todas las muestras evaluadas se encontraban anonimizadas, y correspondían a sujetos con resultados positivos y negativos identificados mediante la RT-qPCR de quienes no se contaba con información adicional.

Las muestras fueron seleccionadas de manera no probabilística por conveniencia, la evaluación por RT-LAMP fue cegada (los evaluadores desconocían el resultado previo por RT-qPCR). El uso de las muestras fue autorizado por resolución jefatural n.º 00006918, decreto de emergencia sanitaria n.º 0064-2020-OGA/INS (7 de abril de 2020) y nota informativa n.º 0055-2020 «Plan de Acción del Instituto Nacional de Salud para Prevención, Diagnóstico y Control de COVID-19, en el marco del Decreto Supremo Nº008-2020-SA».

Extracción de ARN

La extracción de ARN de todas las muestras se realizó utilizando el kit de purificación de ARN total GenElute™ (Sigma-Aldrich - Merck), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/viral-rna-purification.html), luego se congeló a -80 ºC hasta su posterior procesamiento.

Reacción RT-qPCR

Las reacciones fueron estandarizadas en Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit (Qiagen, Alemania) usando cebadores y sondas para detección de SARS-CoV-2 (RdRP) y un control interno (GAPDH humano) (canal verde, FAM: 470-510nm y anaranjado, ROX: 585-610nm, respectivamente). Fueron consideradas positivas cuando se obtuvo valores de umbral de ciclo (Ct) < 37 (FAM) y Ct < 40 (ROX), concomitantemente. Las secuencias de cebadores, sondas y condiciones de reacción se encuentran disponibles en el material suplementario. Más información de la prueba RT-qPCR in house disponible en esta dirección: http://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bsm2nc8e.

Reacción RT-LAMP

Las reacciones de RT-LAMP se realizaron de acuerdo con lo establecido por Lamb et al. ⁽¹⁵⁾, utilizando WarmStart®️ Colorimetric LAMP 2X Master Mix ADN y ARN (Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan), que contiene un indicador de pH que permite la visualización colorimétrica. La solidez se probó a partir de la concentración de cebadores estándar y el volumen final de reacción. Fueron usados 44 µM de los primers FIP (16 µM), BIP (16 µM), F3 (2 µM), B3 (2 µM), LOOP F (4 µM), BUCLE B (4 µM), y 56 µM de agua; además se empleó 20 µL de los reactivos MIX-LAMP (12,5 µL), MIX-Primers (2,5 µL), RNA (5 µL), y 5 µL de agua. Las reacciones fueron realizadas a 65 °C por 45 minutos, y a 80 °C por 5 minutos.

Validación en campo

Posterior a la validación en laboratorio, se llevó a cabo la evaluación en campo, para lo cual se seleccionaron personas sospechosas de infección por COVID-19 con hasta 15 días de síntomas, quienes acudieron a hospitales de Lima (Hospital Cayetano Heredia, Hospital Hipólito Unanue y Hospital Arzobispo Loayza), y personas que fueron evaluadas por equipos de atención domiciliaria (equipos de respuesta rápida) entre agosto y septiembre de 2020. Se incluyeron personas mayores de 18 años, con síntomas leves, sin diagnóstico previo de COVID-19 por prueba molecular; se excluyeron a mujeres embarazadas, y a pacientes graves o críticos. El tamaño de muestra para esta etapa se basó en el mismo cálculo realizado para la validación en laboratorio debido a que compartían el mismo objetivo (identificar medidas de rendimiento diagnóstico) aunque en muestras de diferente origen (almacenadas y obtenidas directamente); para la selección de sujetos en campo se siguió un muestreo no probabilístico consecutivo.

Se registró el sexo, la edad y el cuadro clínico de cada paciente, y el tiempo de enfermedad, en días, desde el inicio de los síntomas. A cada participante se le realizó un HNF, utilizando el kit de muestreo de Yocon Biology Technology Company, que incluye medios de transporte viral e hisopos de dacrón en bandada. Las muestras fueron trasportadas el mismo día al INS mediante contenedores triples con acumuladores de frío, a temperaturas entre 2 °C a 8 °C. Todas las muestras fueron analizadas siguiendo el procedimiento previamente descrito. Los resultados de la RT-qPCR y RT-LAMP se obtuvieron de forma simultánea de dos laboratorios distintos, los evaluadores de cada laboratorio desconocían los resultados de la prueba contraria que analizaban.

Análisis estadístico

El análisis de los datos se realizó utilizando el paquete estadístico Stata versión 16.1 (Stata Corporation, College Station, Texas, EE. UU.). Se emplearon medidas de resumen de frecuencia y porcentaje para las características clínicas y epidemiológicas de la muestra de sujetos evaluados en la validación de campo. Tanto para la validación de laboratorio como de campo, se determinó el grado de concordancia entre los resultados de la prueba de RT-qPCR y de RT-LAMP mediante el índice Kappa de Cohen. También se calculó la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, valor de la exactitud y el área bajo la curva para la RT-LAMP. Se realizaron análisis estratificados de los resultados de campo según semana de enfermedad ^(16,17), esto no fue factible para las muestras de laboratorio al no contar con la información sobre el tiempo de enfermedad, los sujetos que no contaron con el tiempo de enfermedad fueron excluidos de la evaluación estratificada. Las medidas fueron calculadas a través de estimadores puntuales e intervalos de confianza al 95% (IC 95%), las inferencias se realizaron considerando un nivel de significancia de 0,05.

Consideraciones éticas

La estandarización y validación en laboratorio no requirió evaluación por el Comité Institucional de Ética en Investigación (CIEI), ya que las muestras empleadas fueron obtenidas en las actividades rutinarias establecidas dentro del plan de acción del INS, resaltando además que las mismas se encontraban anonimizadas. Por su parte, la validación de campo se llevó a cabo mediante un protocolo de investigación aprobado por el CIEI del INS, tal como se muestra en la RD n.º 283-2020-OGITT-INS. Todos los sujetos de estudio incluidos en esta fase brindaron su consentimiento informado para participar y se les reportó sus resultados en menos de 72 horas.

RESULTADOS

Evaluación de desempeño de la RT-LAMP en comparación con la RT-qPCR

El límite de detección de SARS-CoV-2 por RT-LAMP fue de 1000 copias/µL; eso indicó que todos los casos en que los valores de Ct < 30 fueron concordantes entre RT-qPCR y RT-LAMP (Figura 1, Tabla 1). En las evaluaciones de robustez, se obtuvieron reacciones de alto rendimiento con la mitad de las concentraciones de cebadores (0.5P) y con 20 µL de volumen final (0.8V del volumen final de la reacción estándar).

Figura 1. Curva estándar de reacciones de RT-qPCeR (panel A) y límite de detección por RT-LAMP (panel B) para la detección de SARS-CoV-2.

Tabla 1. Comparación del límite de detección entre las reacciones por RT-qPCR y RT-LAMP para detectar la presencia de SARS-CoV-2.

Ct: umbral de ciclo, RT-qPCR: Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, RT-LAMP: Transcripción reversa-Amplificación Isotérmica Mediada en Lazo

Validación de laboratorio

El análisis de reacción cruzada realizada in silico, no identificó similitud consistente con las secuencias de referencia de otros coronavirus humanos (NL-63, HKU1, OC43, 229E, SARS-CoV-1, MERS y HECoV, Figura 2). Además, cuando estos mismos cebadores se alinearon con 194 cepas peruanas disponibles en la iniciativa GISAID no hubo exclusión de regiones conservadas, que exhiben una alta similitud y especificidad, lo que puede designarse como ausencia de detección concomitante de otros coronavirus humanos distintos del SARS-CoV-2.

Figura 2: Alineación de múltiples secuencias entre los primers F3 y B3 para RT-LAMP y las secuencias de referencia de todos los coronavirus humanos cono­cidos, así como con todas las cepas peruanas de SARS-CoV-2 disponibles en la iniciativa GISAID. La alineación fue realizada en ClustalW usando MEGA. La secuencia de primers (panel A – F3, panel B – B3) fueron alineadas con todas las secuencias de referencia de coronavirus humanos conocidos (NC_005831.2, HCoV-NL63; NC_002645.1, HCoV-229E; NC_006213.1, HCoV-OC43 cepa ATCC VR-759; NC_006577.2, HCoV-HKU1; NC_004718.3, SARS-CoV-1; NC_019843.3, MERS; FJ415324.1, HECoV-4408 and NC_045512.2, SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 aislada) y todas las 194 cepas peruanas de SARS-CoV-2 (panel C – F3, panel D – B3). La columna amarilla en los paneles A y B, y los asteriscos en los paneles C y D, representa regiones conservadoras en el fragmento del gen nsp3 entre todos los coronavirus humanos conocidos y todas las cepas peruanas de SARS-CoV-2 de genoma completo, respectivamente.

Para la evaluación del rendimiento diagnóstico en laboratorio se incluyeron finalmente 384 muestras, de las cuales 37,2% (n=143) tenían previamente resultados positivos por RT-qPCR; al obtenerse los resultados por RT-LAMP se identificó una concordancia estadísticamente significativa (p < 0,001) de 0,88 (IC 95%: 0,83–0,93) por la prueba de Kappa. Se encontraron tres falsos positivos (FP) con una tasa de falsos positivos (TFP) de 1,2%; además, se tuvo 18 falsos negativos (FN) con una tasa de falsos negativos (TFN) de 12,6% (Tabla 2).

Tabla 2. Análisis de concordancia entre los resultados de las evaluaciones en laboratorio y campo obtenidos por las pruebas RT-qPCR y RT-LAMP 

IC 95%: intervalo de confianza al 95%, VP: verdadero positivo, VN: verdadero negativo, FP: falso positivo, FN: falso negativo, PFP: proporción de falsos positivos, PFN: proporción de falsos negativos, RT-qPCR: Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, RT-LAMP: Transcripción Reversa-Amplificación Isotérmica Mediada en Lazo

La sensibilidad obtenida con las muestras evaluadas fue de 87,4% (IC 95%: 80,8–92,4), la especificidad fue de 98,8% (IC 95%: 96,4–99,7), el valor predictivo positivo de 97,7% (IC 95%: 93,3–99,5), y el negativo de 93,0% (IC 95%: 89,1–95,8); el valor de la exactitud de la prueba fue de 94,5 % (IC 95%: 91,8–96,6), y el área bajo la curva ROC fue de 93,1 % (IC 95%: 90,3–95,9) (Tabla 3).

Tabla 3. Medidas de rendimiento diagnóstico del RT-LAMP en validación en laboratorio y en campo, considerando los resultados de RT-qPCR como estándar de referencia.

IC 95%: intervalo de confianza al 95%, RT-qPCR: Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, RT-LAMP: Transcripción Reversa- Amplificación Isotérmica Mediada en Lazo

Validación de campo

Para esta etapa del estudio fueron incluidos 383 sujetos según los aspectos previstos en el protocolo de investigación, de los cuales el 51,7% (n=198) fueron mujeres, el grupo etario más frecuente fue de adultos jóvenes (n=236, 61,6%). Los síntomas más frecuentes encontrados fueron tos (n=268, 70,0%) y dolor faríngeo (n=262, 68,4%); la media del tiempo de enfermedad fue de 7,1 (DE: 3,3) días; el 56,1% se encontraba en la primera semana de enfermedad y el 43,6% en la segunda semana, se identificó un sujeto (0,3%) que no recordaba la fecha de inicio de sus síntomas, el cual fue excluido en la evaluación estratificada por tiempo de enfermedad (Tabla 4).

Tabla 4. Características clínicas y epidemiológicas de los sujetos evaluados en campo.

1. World Health Organization. Weekly epidemiological update - 5 January 2021 [Internet]. Ginebra: WHO; 2021 [citado el 25 de enero de 2021]. Disponible en: https://www.who.int/publications/m/item/weekly-epidemiological-update---5-january-2021.

2. Del Brutto OH, Costa AF, Mera RM, Recalde BY, Bustos JA, García HH. SARS-CoV-2-related mortality in a rural Latin American population. Int J Infect Dis. 2020;99:226–8. doi: 10.1016/j.ijid.2020.08.003.

3. Wölfel R, Corman VM, Guggemos W, Seilmaier M, Zange S, Müller MA, et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 2020;581(7809):465–9. doi: 10.1038/s41586-020-2196-x.

4. Organización Mundial de la Salud. Pruebas diagnósticas para el SARS-CoV-2: orientaciones provisionales, 11 de septiembre de 2020 [Internet]. Ginebra: OMS; 2021 [citado el 25 de enero de 2021]. Disponible en: https://apps.who.int/iris/handle/10665/335830.

5. Instituto Nacional de Salud. Pruebas moleculares realizadas para el diagnóstico de COVID-19 [Internet]. Lima: INS; 2021 [citado el 25 de enero de 2021]. Disponible en: http://web.ins.gob.pe/es/indicador/pruebas-moleculares-realizadas-para-el-diagnostico-de-covid-19.

6. Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Singh J, Streithorst J, et al. Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay. MedRxiv Prepr Serv Health Sci. 2020. doi: 10.1101/2020.03.06.20032334.

7. Huang WE, Lim B, Hsu C, Xiong D, Wu W, Yu Y, et al. RT‐LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS‐CoV‐2. Microb Biotechnol. 2020;13(4):950–61. doi: 10.1111/1751-7915.13586.

8. Escalante-Maldonado O, Gavilán RG, García MP, Marcelo A, Pacheco E, Cabezas C, et al. Desarrollo y validación del método de amplificación isotérmica mediada en lazo para la detección del virus Zika. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2019;36(3):442–7. doi: 10.17843/rpmesp.2019.363.3941.

9. Gray CM, Katamba A, Narang P, Giraldo J, Zamudio C, Joloba M, et al. Feasibility and Operational Performance of Tuberculosis Detection by Loop-Mediated Isothermal Amplification Platform in Decentralized Settings: Results from a Multicenter Study. J Clin Microbiol. 2016;54(8):1984–91. doi:10.1128/JCM.03036-15.

10. Serra-Casas E, Manrique P, Ding XC, Carrasco-Escobar G, Alava F, Gave A, et al. Loop-mediated isothermal DNA amplification for asymptomatic malaria detection in challenging field settings: Technical performance and pilot implementation in the Peruvian Amazon. PloS One. 2017;12(10):e0185742. doi: 10.1371/journal.pone.0185742.

11. Dauner AL, Mitra I, Gilliland T, Seales S, Pal S, Yang S-C, et al. Development of a pan-serotype reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of dengue virus. Diagn Microbiol Infect Dis. 2015;83(1):30–6. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2015.05.004.

12. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63. doi: 10.1093/nar/28.12.e63.

13. GISAID - Initiative [Internet]. Múnich: GISAID; 2021 [citado el 6 de enero de 2021]. Disponible en: https://www.gisaid.org/.

14. Jiang M, Pan W, Arasthfer A, Fang W, Ling L, Fang H, et al. Development and Validation of a Rapid, Single-Step Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System Potentially to Be Used for Reliable and High-Throughput Screening of COVID-19. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:331. doi: 10.3389/fcimb.2020.00331.

15. Lamb LE, Bartolone SN, Ward E, Chancellor MB. Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. PloS One. 2020;15(6):e0234682. doi: 10.1371/journal.pone.0234682.

16. Carpenter CR, Mudd PA, West CP, Wilber E, Wilber ST. Diagnosing COVID-19 in the Emergency Department: A Scoping Review of Clinical Examinations, Laboratory Tests, Imaging Accuracy, and Biases. Acad Emerg Med Off J Soc Acad Emerg Med. 2020;27(8):653–70. doi: 10.1111/acem.14048.

17. Vidal-Anzardo M, Solis G, Solari L, Minaya G, Ayala-Quintanilla B, Astete-Cornejo J, et al. Evaluación en condiciones de campo de una prueba serológica rápida para detección de anticuerpos IgM e IgG contra SARS-CoV-2. Rev Peru Med Exp Salud Pública. 2020;37(2):203–9. doi: 10.17843/rpmesp.2020.372.5534.

18. Kosack CS, Page A-L, Klatser PR. A guide to aid the selection of diagnostic tests. Bull World Health Organ. 2017;95(9):639–45. doi:10.2471/BLT.16.187468

19. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 2020;25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

20. Case JB, Bailey AL, Kim AS, Chen RE, Diamond MS. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology. 2020;548:39–48. doi: 10.1016/j.virol.2020.05.015.

21. Hu X, Deng Q, Li J, Chen J, Wang Z, Zhang X, et al. Development and Clinical Application of a Rapid and Sensitive Loop-Mediated Isothermal Amplification Test for SARS-CoV-2 Infection. mSphere. 2020;5(4):e00808-20. doi: 10.1128/mSphere.00808-20.

22. Kitagawa Y, Orihara Y, Kawamura R, Imai K, Sakai J, Tarumoto N, et al. Evaluation of rapid diagnosis of novel coronavirus disease (COVID-19) using loop-mediated isothermal amplification. J Clin Virol. 2020;129:104446. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104446.

23. Lu R, Wu X, Wan Z, Li Y, Jin X, Zhang C. A Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2826. doi: 10.3390/ijms21082826.

24. Yu F, Yan L, Wang N, Yang S, Wang L, Tang Y, et al. Quantitative Detection and Viral Load Analysis of SARS-CoV-2 in Infected Patients. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am. 2020; doi: 10.1093/cid/ciaa345.

Financiamiento: Financiado en su totalidad por el INS. El estudio se realizó en el marco de las actividades regulares del INS.

Material suplementario: Disponible en la versión electrónica de la RPMESP.

Citar como:  Escalante-Maldonado O, Vidal-Anzardo M, Donaires F, Solis-Sanchez G, Gallesi I, Pampa-Espinoza L, et al. Estandarización y validación de una prueba molecular RT-LAMP in house para el diagnóstico de SARS-CoV-2. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2021;38(1):7-16. doi: https://doi.org/10.17843/rpmesp.2021.381.7154.

Correspondencia: Oscar Escalante-Maldonado; Jirón Capac Yupanqui 1400, Jesús María, Perú; oscar.escmal@gmail.com

Contribución de los autores: Todos los autores participaron en la concepción y diseño del estudio. LP, CG y EA participaron en la recolección de datos. GS participó en el análisis estadístico de los datos. Todos los autores participaron en la interpretación de los datos, redacción del manuscrito, revisión crítica del manuscrito y aprobaron la versión final. Todos los autores son responsables del contenido del artículo.

Conflictos de interés: Todos los autores menos CG, EA, y JM son personal del INS. Todos los autores declaran no tener conflictos de interés en relación con esta publicación. Cesar Cabezas es miembro del comité editor de la RPMESP. RDC cuenta con el apoyo de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), beca n.º 2019/01255-9, Brasil.

Recibido: 20/01/2021
Aprobado: 24/02/2021
En línea: 09/03/2021